趙丹妮，何國鑫，周 欣，龔小見，程 力，劉 璇，趙 超*

1貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2喀斯特山地生態(tài)環(huán)境保護(hù)與資源利用協(xié)同創(chuàng)新中心 3貴州師范大學(xué) 貴州省藥物質(zhì)量控制及評價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室；4貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心；5貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴陽 550001

小一點(diǎn)紅(Emiliaprenanthoides DC.)又名細(xì)紅背葉、挖耳草等，為菊科一點(diǎn)紅屬植物的干燥全草[1]。在我國南方地區(qū)具有悠久的藥用歷史，其性味苦涼，具有清熱解毒，活血化瘀之功效，主治跌打損傷，紅白痢，瘡瘍腫毒及抗炎消腫等[2-4]?；t片是臨床中廣泛用于治療各種急、慢性婦科炎癥疾病的中成藥，據(jù)《廣西植物志》記載，小一點(diǎn)紅與其同屬植物一點(diǎn)紅為同等藥材入藥[4-6]，小一點(diǎn)紅為其的主要原料藥，但其在婦科炎癥的藥理作用研究卻鮮有報(bào)道。因此本研究以炎癥因子含量、大鼠子宮腫脹度為評價(jià)指標(biāo)，探究小一點(diǎn)紅對慢性盆腔炎大鼠的抗炎作用，通過對子宮病理組織顯微觀察進(jìn)一步探究其藥效學(xué)作用，以期為小一點(diǎn)紅在抗婦科炎癥方面的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

小一點(diǎn)紅藥材采自貴州省都勻市務(wù)川縣大坪鎮(zhèn)，經(jīng)貴陽中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為小一點(diǎn)紅(EmiliaprenanthoideaDC.)干燥全草。

1.2 動物

SD雌性大鼠56只，SPF級，體重190 ± 20 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號SCXK(湘)2014-0011]。

1.3 試劑

婦科千金片(株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號Z43020027)；苯酚膠漿(廣東光華化學(xué)廠，批號20140315)；水合氯醛(酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司，批號G6806V17)；腫瘤壞血因子(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)購自上海喬羽生物科技有限公司；水為蒸餾水和超純水。

1.4 儀器

離心機(jī)(常州市萬和儀器制造有限公司，TDL-5A)；酶標(biāo)儀(美國Moleaular Devices公司，型號Max Plus 384)；十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號XS105)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特有限公司，型號DK-98-Ⅱ)；倒置熒光顯微鏡(廣州市明美光電技術(shù)有限公司，型號，MF53)。

2 方法

2.1 受試藥制備

取干燥小一點(diǎn)紅生藥粉碎，過60目篩，稱取1 kg粗粉，90%乙醇回流提取2次(2 h/次)，料液比1∶10(g∶mL)，合并提取液，濾過，濃縮得浸膏，得率為19.3%。將生藥材與浸膏進(jìn)行換算，配置出高、中、低劑量(0.8、1.6、3.2 g/(kg·d))受試藥混懸液于具塞錐形瓶中，4 ℃中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 造模

參照《中藥現(xiàn)代研究的思路與方法》[7]盆腔炎建立方法，取健康雌性SD大鼠，7%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腹常規(guī)消毒，于正中切口0.8～1 cm，暴露子宮，除假手術(shù)組外，其余大鼠均由注射器針頭機(jī)械損傷右側(cè)子宮壁，并由右側(cè)子宮向卵巢方向推注25%苯酚膠漿(0.05 mL/只)，注畢，分層縫合關(guān)腹，消毒，術(shù)后正常喂養(yǎng)。

2.3 分組及給藥

造模大鼠正常飼養(yǎng)7天，除空白組和假手術(shù)組外，隨機(jī)分為5組，每組8只，即模型組、婦科千金片陽性組(0.86 g/(kg·d))、小一點(diǎn)紅高、中、低劑量組(0.8、1.6、3.2 g/(kg·d))?？瞻捉M、模型組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥14天。

2.4 血清中TNF-α、IL-2、IL-6水平測定

末次給藥后禁食不禁水12 h，腹主動脈取血，于4 ℃ 3 500 rpm離心10 min，分離血清于密封試管中，-20 ℃儲存，ELISA法檢測大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-2、IL-6含量。

2.5 子宮指數(shù)測量與計(jì)算

取血后脫頸椎處死大鼠，解剖取左側(cè)及右側(cè)子宮，稱重，并按下列公式計(jì)算各組大鼠子宮的腫脹度、腫脹率和抑制率。

腫脹度=|m右側(cè)子宮-m左側(cè)子宮|

2.6 組織病理學(xué)變化觀察

將稱重后的左右側(cè)子宮浸于10%福爾馬林中固定48 h，取出后經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色、封片等步驟，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠子宮組織病變情況，根據(jù)表3中的病變組織觀察指標(biāo)及評分標(biāo)準(zhǔn)[8]對大鼠子宮病理組織進(jìn)行打分。

2.7 統(tǒng)計(jì)處理

3 結(jié)果

3.1 小一點(diǎn)紅醇提物對慢性盆腔炎大鼠子宮指數(shù)的影響

各組大鼠子宮腫脹度、腫脹率及抑制率見表1所示。與假手術(shù)組比較，空白組大鼠子宮腫脹程度與假手術(shù)組中大鼠體內(nèi)子宮腫脹程度并無顯著性差異(P> 0.05)，提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致子宮腫脹；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮腫脹度增加，腫脹率升高(P< 0.01)，提示慢性盆腔炎大鼠造模成功；與模型組大鼠比較，婦科千金片陽性組、小一點(diǎn)紅高、中、低劑量組大鼠子宮腫脹度、腫脹率均有所降低(P< 0.05)，各組的抑制率分別達(dá)到52.43%、49.25%、56.29%和36.79%。

表1 小一點(diǎn)紅乙醇提取物對慢性盆腔炎大鼠子宮腫脹度的影響Table 1 Effect of ethanol extract on uterine swelling in rats with chronic pelvic inflammatory s,n=8)

3.2 小一點(diǎn)紅提取物對慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-6的影響

如表2所示，與假手術(shù)組比較，空白組大鼠體內(nèi)炎癥因子含量與假手術(shù)組中大鼠體內(nèi)炎癥因子含量并無顯著性差異(P> 0.05)，提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致感染和炎癥；模型組的TNF-α、IL-2、IL-6顯著增大(P< 0.01)，提示實(shí)驗(yàn)中造模成功。與模型組比較，婦科千金片陽性組、小一點(diǎn)紅高劑量組(IL-2、TNF-α)、中劑量組(IL-2)、低劑量組(IL-2、TNF-α)顯著降低(P< 0.05)。

表2 小一點(diǎn)紅乙醇提取物對慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-6含量影響Table 2 Effect of ethanol extract on serum TNF-α,IL-2,IL-6 level in rats with chronic pelvic inflammatory s,n=8)

表3 慢性盆腔炎模型大鼠子宮組織切片病變評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring criteria of uterine tissue slice lesions in rats with CPID

3.3 小一點(diǎn)紅對慢性盆腔炎子宮組織病變的影響

如圖1所示，空白組子宮組織細(xì)胞核圓潤，排列緊密，界限清晰，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)易于分化，無組織黏連(見圖A)；模型組中組織黏連，大量炎性細(xì)胞浸潤并出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，細(xì)胞核破損，部分細(xì)胞核變性壞死(見圖B)；假手術(shù)組中，出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞，但組織黏連破損，細(xì)胞排列緊密(見圖C)；與模型組比較，陽性對照組細(xì)胞分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰完整，有少量炎性細(xì)胞浸潤，有輕微組織破損和黏連，見圖D；與模型組比較，小一點(diǎn)紅高、中、低給藥組，細(xì)胞核破損程度減輕，細(xì)胞核較圓滑，且分布均勻，炎癥浸潤且組織黏連程度減輕(見圖E、F、G)。

圖1 小一點(diǎn)紅對慢性盆腔炎大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)的影響(×400)Fig.1 Effect of EP on the pathomorphology of uterine tissue in rats with chronic pelvic inflammation (×400)注：A：空白組；B：模型組；C：假手術(shù)組；D：陽性組；E：小一點(diǎn)紅高劑量組； F：小一點(diǎn)紅中劑量組；G：小一點(diǎn)紅低劑量組。Note:A:Blank group;B:Model group;C:Control group;D:Positive group;E:High EP dose group;F:Medium EP dose group;G:Low EP dose group.

3.4 對慢性盆腔炎子宮組織病變形態(tài)評分分析

對比慢性盆腔炎大鼠子宮病理形態(tài)的評分結(jié)果見表4，與假手術(shù)比較，空白組大鼠子宮組織病理形態(tài)無顯著性差異(P> 0.05)，提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致子宮病理形態(tài)變化；與模型組對比，小一點(diǎn)紅中劑量給藥組對宮腔黏連、上皮細(xì)胞變性或壞死、慢性炎細(xì)胞浸潤、慢性炎細(xì)胞浸潤評分?jǐn)?shù)值均小于模型組(P< 0.05)，高劑量給藥組對上皮細(xì)胞變性或壞死和內(nèi)膜充血水腫評分?jǐn)?shù)值均小于模型組(P< 0.05)，低劑量給藥組對上皮細(xì)胞變性或壞死、慢性炎細(xì)胞浸潤和內(nèi)膜充血水腫評分?jǐn)?shù)值均小于模型組(P< 0.05)。

表4 慢性盆腔炎性模型大鼠子宮組織病理形態(tài)的評分Table 4 Scores of pathological morphology of uterine tissue in CPID model rats

4 討論

慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)是女性內(nèi)生殖器及周圍結(jié)締組織、腹膜的慢性非特異性炎癥，是較為常見及多發(fā)的婦科疾病[9]。治療過程中單一使用抗生素治療效果不佳，無法使患者全面治愈且具有毒副作用[10,11]，而中醫(yī)藥在慢性盆腔炎的治療中具有多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，發(fā)揮出西藥不可比擬的作用[12]。在中醫(yī)理論中歸屬于“婦人腹痛”、“帶下病”、“癥瘕”、“不孕”等病癥，其主要病因歸屬為臟腑失調(diào)、勞倦過度、氣血失和、經(jīng)絡(luò)氣血受阻，故中醫(yī)藥治療該病多以清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)止痛為主[13]。小一點(diǎn)紅因其清熱解毒、活血化瘀、抗炎消腫的功效，在婦科炎癥方面具有不可忽視的開發(fā)研究價(jià)值。

TNF-α、IL-6、IL-2被認(rèn)為是重要促炎細(xì)胞因子[14]，在炎癥反映初期，體內(nèi)TNF-α含量升高，激活機(jī)體的中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)多種炎癥因子的釋放，包括IL-6和IL-2的釋放[15]。IL-6、IL-2是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)，與周身的炎癥反映有關(guān)，其在體內(nèi)的含量可較確切的反映出機(jī)體的炎癥情況[16]。本研究中以小一點(diǎn)紅的乙醇提取物為供試藥對慢性盆腔炎大鼠的療效進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)小一點(diǎn)紅可以有效抑制慢性盆腔炎大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2炎癥因子的產(chǎn)生，降低大鼠子宮的腫脹度，改善子宮組織病理情況，表明小一點(diǎn)紅對慢性盆腔炎大鼠有較好的療效。本研究結(jié)果與Jiang等[4]對小一點(diǎn)紅的抗炎作用研究結(jié)果一致，均表明小一點(diǎn)紅可降低炎癥大鼠體內(nèi)的TNF-α含量，具有抑制和降低大鼠體內(nèi)炎癥的作用。同時(shí)小一點(diǎn)紅醇提物中含有綠原酸、槲皮苷等具有抗炎抗氧化等作用的黃酮類物質(zhì)，且含量較大[17]，進(jìn)一步證實(shí)了小一點(diǎn)紅的抗炎作用。

在臨床中，花紅片用于治療盆腔炎性疾病后遺癥濕熱瘀結(jié)證患者療效顯著[18,19]，小一點(diǎn)紅作為其原料藥，本研究中證實(shí)了其在慢性盆腔炎大鼠中抗炎作用的療效，小一點(diǎn)紅與一點(diǎn)紅在外形上相差無幾，成分相仿[4,20]，且在《廣西植物志》中記載為同等藥材入藥，則提示一點(diǎn)紅和小一點(diǎn)紅可能是花紅片中治療盆腔炎疾病重要的藥效原料藥材之一。本研究為小一點(diǎn)紅藥材合理用藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，并為花紅片在臨床中的合理利用提供參考。但小一點(diǎn)紅對大鼠體內(nèi)炎癥因子抑制通路尚未證實(shí)，還有待進(jìn)一步深入研究。