王曉斐，王 青，王玲彩，杭柏林，孫亞偉，王 磊，胡建和，徐彥召

（河南科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

河南省地處中原地區(qū)，2017 年生豬出欄量達到6 220 萬頭，成為中國第一養(yǎng)豬大省。除了2018 年席卷全國的非洲豬瘟，河南豬群中還存在相對嚴重的豬病毒性傳染病，尤其是仔豬的消化系統(tǒng)疾病是導致仔豬大量死亡的主要原因[1]。這些危害仔豬胃腸道健康的主要疾病有：以豬流行性腹瀉（PED）、豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬輪狀病毒病（PoR）、豬細環(huán)病毒病等為代表的病毒性疾病，以大腸桿菌病、沙門氏菌病、魏氏梭菌、豬痢疾等為代表的細菌性疾病，以及以弓形體病和球蟲病等為代表的寄生蟲病。在這些疾病中以豬流行性腹瀉為代表的病毒性疾病是導致仔豬病情快速、群發(fā)、難控的主要疾病[2-4]。因此，在某種程度上，控制好仔豬的腹瀉性疾病是決定豬場出欄數(shù)的關鍵指標。

豬病毒性流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、TGEV、PoRV 以及豬細小病毒等引起豬的一種高度接觸性腸道病毒性傳染病。盡管目前針對部分病原已有相對應的商品化疫苗，但該病在豬群中仍有發(fā)生[5-7]。其中，PEDV 可感染各年齡段的豬，導致其出現(xiàn)嘔吐、水樣腹瀉等癥狀，其對新生仔豬的致病率和致死率可達100%[7]。

PEDV 屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA 病毒，其基因組含有約28 000 nt，編碼7 個ORF，可翻譯出2 個非結構蛋白和5 個結構蛋白[8]。其中，纖突蛋白（S 蛋白）在病毒與宿主（細胞）受體結合、侵入、誘導宿主產(chǎn)生中和抗體以及病毒抗原和毒力變異等方面都發(fā)揮重要的生物學作用。同時，S 基因變異性較高，不同PEDV S 基因存在核苷酸的插入、刪減等現(xiàn)象，因此S 基因常被用來分析不同時間和不同地區(qū)PEDV 流行株的親緣關系[9]。

ORF3 蛋白由位于E 蛋白基因和S 蛋白基因之間的ORF3 基因編碼。研究表明缺失ORF3 蛋白可以導致病毒在宿主體內的毒力降低或者弱化，但缺失該蛋白后并不影響病毒在體內的增殖與復制[8]。有研究者對PEDV 野毒株和致弱株的ORF3 基因序列的比對分析發(fā)現(xiàn)，致弱株的ORF3 基因序列中存在51 個核苷酸的缺失[10-11]。因此，對新分離株進行ORF3 基因的序列分析，可以間接分析該病毒株毒力的強弱。

本研究對2019 年2 月來自河南省焦作地區(qū)某豬場送檢的臨床腹瀉病豬的腸道內容物樣品進行RTPCR 檢測，并對其中的1 份PEDV 陽性樣品進行了病毒的分離鑒定，并對該分離株的S 基因和ORF3 基因進行同源性及遺傳進化關系分析，為該病在河南地區(qū)的分子流行病學研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品與主要試劑 5 份病料樣品采自2019年河南焦作地區(qū)某豬場腹瀉仔豬腸道內容物，置于-70 ℃保存?zhèn)溆?。PEDV N 蛋白單克隆抗體（MAb）購自Mybiosource 公司；FITC 標記的兔抗鼠IgG-FTIC購自Solarbio 公司；Hoechst33342 購自上海碧云天生物技術有限公司；RNA 提取試劑盒和質粒提取試劑盒購自Omega 公司；反轉錄相關試劑、PCR 相關試劑、DL15000 DNA Marker、pMD19-T 載體及T4 DNA連接酶均購自TaKaRa 公司。

1.2 引物設計 豬病毒性腹瀉相關病原PEDV、TGEV 及PoRV 的PCR 檢測引物參考王康等人[12]的研究；根據(jù)GenBank 中PEDV CV777 株（AF353511）的S基因和ORF3 基因序列設計引物。引物序列如下：S-UP： ATGAAGTCTTTAACTTACTTCTGGT/S-DP：TCACTGCACGTGGACCTTTTC；ORF3-UP：ATGTTTC TTGGACTTTTTCAAT/ORF3-DP：TCATTCACTAATTG TAGCATACTC。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 腹瀉樣品的檢測 腸道內容物樣品經(jīng)滅菌PBS重懸后，12 000 r/min 離心5 min 后取上清液，利用試劑盒提取上清液中的總RNA，反轉錄為cDNA，以其為模板，利用王康等人[12]報道的PEDV、TGEV及PoRV 的PCR 方法檢測與仔豬腹瀉相關的病毒。

1.4 病毒分離及間接免疫熒光（IFA）鑒定 隨機選取1 份PEDV 陽性的腸內容物樣品上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，將其與胰蛋白酶混勻后接種于6 孔板中對數(shù)生長期的單層Vero 細胞，每天均觀察接種細胞有無CPE 出現(xiàn)；無論接種細胞是否出現(xiàn)CPE，均收集細胞上清繼續(xù)接種Vero 細胞傳代培養(yǎng)，于接種病毒后72 h 收獲培養(yǎng)病毒[12]。收獲傳代到第3 代（F3）、第5 代（F5）的細胞上清液，提取其總RNA，反轉錄為cDNA，利用1.2 中PEDV 的引物經(jīng)PCR 檢測。

分別將上述收獲的F3 和F5 代的病毒上清液接種于6 孔板中新鮮培養(yǎng)的Vero 細胞，24 h 后棄去上清液，PBS 洗滌后，用80 %的冷乙醇，4 ℃固定細胞1 h，然后以PEDV N 蛋白MAb（1 2 000）作為一抗，以兔抗鼠IgG-FITC（1 4 000）為二抗，經(jīng)Hoechst33342 細胞核染色后，對分離的病毒經(jīng)IFA鑒定，并在倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5 分離病毒的S 基因和ORF3 基因的PCR 擴增、同源性及遺傳進化分析 提取分離病毒感染后細胞的總RNA，反轉錄為cDNA，利用1.2 中的引物進行全長S 基因和ORF3 基因的PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物分別克隆至pMD19-T 載體中，構建重組質粒pMD-S 和pMD-ORF3，并由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

利用DNAStar 和MegAlign 等軟件將分離病毒的S基因和ORF3 基因與GenBank 中的已登錄的PEDV 相應基因進行同源性分析；利用MEGA-X 軟件構建S基因和ORF3 基因的遺傳進化樹，并分析該分離病毒的遺傳進化特點。

2 結果與討論

2.1 臨床樣品的RT-PCR 檢測結果 按照文獻中的引物，利用RT-PCR 方法對送檢的5 份仔豬腹瀉腸內容物樣品進行檢測。結果顯示，5 份樣品的PEDV 檢測結果均為陽性（從樣品中均擴增出預期大小約為700 bp PEDV 基因片段）；而TGEV 和PoRV 的檢測結果均為陰性（圖略）。表明，引起該豬場仔豬發(fā)生腹瀉的病原主要是PEDV。

2.2 病毒的分離及IFA 鑒定結果 隨機選取1 份感染PEDV 的豬腸道內容物樣品處理后的上清液接種單層Vero 細胞中盲傳至第3 代時（每個代次培養(yǎng)約72 h）可見感染細胞出現(xiàn)細胞融合而產(chǎn)生核胞體的CPE（圖略）。收獲細胞上清液即為F3 代病毒，繼續(xù)對分離的病毒傳代至F5 代收獲細胞上清液，提取F3 代、F5 代細胞上清液中的總RNA，反轉錄為cD?NA，利用1.2 中PEDV 的引物經(jīng)PCR 檢測。結果顯示，F(xiàn)3 代、F5 代的細胞上清液中均能擴增出PEDV特異性核酸條帶。

利用PEDV 特異性MAb 對分離病毒的F3 和F5 代進行IFA 鑒定。在倒置熒光顯微鏡下可見，感染兩個代次PEDV 后的Vero 細胞均出現(xiàn)特異性的綠色熒光（圖1）。進一步表明分離的病毒為PEDV，將其命名為jiaozuo1012/2019 株。

圖1 分離病毒的IFA 鑒定結果Fig. 1 IFA detection of isolated PEDV

2.3 分離病毒S 基因和ORF3 基因的PCR 擴增結果利用1.2 中引物對分離的PEDV 進行S 基因和ORF3基因的PCR 擴增。結果顯示，分別擴增出大小約4 000 bp、600 bp 的目的基因，均與預期的S 基因和ORF3 基因大小一致（圖2）；測序結果顯示，分離的PEDV S基因全長為4 161 bp，ORF3基因全長為675 bp。表明，正確克隆了PEDV分離株的S基因和ORF3基因。

圖2 分離病毒的S 和ORF3 基因的RT-PCR 擴增結果Fig. 2 Amplification results of S and ORF3 gene by RT-PCR

2.4 分離病毒S 基因和ORF 基因同源性及其遺傳進化分析結果 S 基因的同源性分析結果顯示，PEDV 分離株與國內外參考株的同源性為92.9%～99.3%。其中，與2015 年河南省分離的CH/HNLH/2015 株的同源性最高，為99.3%；與近年來河南分離株CH/HNYF/14、CH/HNZZ47/2016、CH/HNAY/2015 S基因的同源性分別為96.4%、98.4%和99.0%；與經(jīng)典株CV777 的同源性較低，為93.4%。利用DNAStar軟件分析該分離病毒的S 基因共編碼1 386 個氨基酸。S 基因編碼的氨基酸序列分析結果顯示，與CV777 株 相 比，jiaozuo1012/2019 株 在aa59～aa62 連 續(xù)性插入4 個氨基酸（59QGVN62）；在aa140 和aa163～aa164分別存在1個和2個氨基酸的缺失（140N和163NI164）。S 基因的進化樹結果顯示，分離株jiaozuo1012/2019與目前河南省廣泛流行的PEDV 親緣關系最近，同處于一個分支（圖3A）。

ORF3 基因序列的同源性分析結果顯示，分離的PEDV 與國內外參考株的同源性為92.8%～99.7%。其中，與2016 年江蘇省分離的JSCZ/1601 株的同源性最高，為99.7%；與近年來河南分離株的同源性為98.5%～99.6%；與經(jīng)典株CV777 的同源性較低，為96.6%。利用DNAStar 軟件分析該分離病毒的ORF3 基因共編碼224 個氨基酸。ORF3 基因的進化樹結果顯示，分離株jiaozuo1012/2019 與2015 年以來國內流行的PEDV 親緣關系最近，同處于一個分支（圖3B），與S 基因的進化樹分析結果一致。

分離株與PEDV 經(jīng)典株進化關系較遠，卻具有近年來國內PEDV 流行株的分子特征，表明，分離的PEDV 為一株流行株。

本研究鑒定了2019 年河南某豬場發(fā)生仔豬腹瀉疫情的病原為PEDV，并利用Vero 細胞分離獲得了PEDV 自然感染株（jiaozuo1012/2019）。分離株經(jīng)S 基因和ORF3 基因的克隆、測序及分析，進一步證實該株PEDV 與近年來河南地區(qū)PEDV 流行株突變特征一致，為PEDV 新的流行株[13]。本研究結果為深入探究PEDV 新流行株的致病性和致病機理奠定了基礎。

圖3 基于S 基因（A）和ORF3 基因（B）構建的PEDV 進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree analysis based on S gene(A) and ORF3 gene (B) of the PEDV isolate