王婷婷，王志浩，米潔蘭，王文騫，高玉龍，劉長軍，祁小樂，張艷萍，李 凱，高 立，潘 青，王笑梅，崔紅玉

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽β-防御素6（AvBD6）是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的宿主防御蛋白，屬于禽β-防御素（AvBDs）的一種，該基因完整的核苷酸序列包含204 bp 開放閱讀框，編碼67 氨基酸，包括20 氨基酸的信號肽，5 個前體氨基酸和42 個氨基酸的成熟肽。AvBD6 是具有廣譜抗菌活性的陽離子小肽[1]，除抗菌功能外，β-防御素還表現(xiàn)出多種免疫調(diào)節(jié)活性，是先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。AvBD 對免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]，β-防御素可由吞噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生，可啟動、動員并增強宿主適應(yīng)性免疫防御[3]。β-防御素不僅具有增強巨噬細胞活性、趨化性單核細胞、T 淋巴細胞、肥大細胞和未成熟樹突細胞的吞噬作用，還能夠誘導(dǎo)促炎細胞因子和免疫調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生[4]。

在免疫調(diào)節(jié)方面，研究表明β-防御素顯示出強大的免疫佐劑潛力，可以顯著提高疫苗的免疫效力[5]。盡管已報道利用大腸桿菌表達系統(tǒng)能夠表達重組AvBD[6]，但表達產(chǎn)物均以包涵體形式存在，而將包涵體形式的AvBD6 經(jīng)過變性再復(fù)性最終形成具有生物活性的AvBD6 過程復(fù)雜[7]，且殘留有種類繁多的內(nèi)毒素。因此，研究開發(fā)出一種無內(nèi)毒素、食品安全級、高效、簡便和低成本的蛋白表達和生產(chǎn)方式是一個亟待解決的問題。

益生乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）被定義為當(dāng)以適當(dāng)?shù)牧拷o予宿主時會給宿主帶來健康益處的微生物，并且已經(jīng)證明它們在宿主中表現(xiàn)出各種生理功能，例如改善腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)免疫功能和能量代謝等[8-9]。近年的研究表明，乳酸菌尤其是腸道乳酸菌是機體免疫系統(tǒng)的最大免疫調(diào)節(jié)信使，益生乳酸菌菌體較大，表面積大，不存在內(nèi)毒素，可以粘附黏膜細胞并短暫定居黏膜表面，對黏膜免疫系統(tǒng)和全身免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，組成腸道菌-腸-腦免疫軸、腸-肝免疫軸和腸-肺免疫軸等。此外，LAB 細胞壁和核酸等成分本身就具有一定的免疫佐劑活性，重組乳酸菌作為表達和遞送治療性和預(yù)防性外源藥物的活載體，是激活免疫應(yīng)答的理想制劑[7]。本研究采用食品級乳酸菌表達載體，構(gòu)建了表達AvBD6 的重組乳酸菌，并檢測了重組乳酸菌表達的重組禽防御素的免疫調(diào)節(jié)活性，為食品安全級疫苗佐劑或免疫增強劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 乳酸菌表達骨架質(zhì)粒pPG612和乳酸乳球菌NZ3900 感受態(tài)細胞、雞巨噬細胞系、J774-DualTM報告細胞系等由本實驗室保存； SPF 雞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，抗凝血采自6 周齡～7 周齡SPF 雞。

1.2 主要試劑 Primer STAR Max DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；蛋白Marker購自Thermo Fisher 公司；HA 單克隆抗體（MAb）購自Biodragon 公司；山羊抗鼠IgG-HRP 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自Axy?gen；One Step Cloning Kit 購自Vazyme 公司；雞外周血單個核細胞分離液購自天津TBD 公司；檢測IL-10、IL-12p70 的SYBY Green Ⅰ熒光定量PCR 試劑盒購自Roche 公司；檢測IL-10、IL-2、IFN-γ 的ELISA 試劑盒購自Solarbio 公司。

1.3 目的基因AvBD6 的優(yōu)化及合成 根據(jù)GenBank AvBD6 的參考序列（NM_001001193.1），去掉AvBD6分泌信號肽序列，利用編碼（G4S）3的蛋白Linker 基因序列（GGTGGCGGCGGATCT）將AvBD6 串聯(lián)起來，拼接成為AvBD6（G4S）3AvBD6（G4S）3AvBD6（G4S）3AvBD6（4×AvBD6）基因序列，由Genescript 公司根據(jù)乳酸菌密碼子偏嗜性進行基因優(yōu)化并合成。

1.4 引物的合成及優(yōu)化 根據(jù)優(yōu)化合成后的4×AvBD6 序列，設(shè)計擴增4×AvBD6 的引物4×AvBD6-F/R（注：單橫線部分為同源臂，雙橫線部分為HA 標(biāo)簽）；設(shè)計載體pPG612 的擴增引物pPG612-F/R；根據(jù)構(gòu)建后的重組質(zhì)粒設(shè)計測序引物tAvBD6-F/R；設(shè)計SYBY Green Ⅰ熒光定量PCR 檢測IL-10 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的引物IL-10-F/R 及檢測IL-12p70 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的引物IL-12p70-F/R（表1）。所有引物均由庫美科技生物有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 重組質(zhì)粒pPG612-AvBD6HA的構(gòu)建及鑒定 以4×AvBD6 為模板，4×AvBD6-F/R 為引物PCR 擴增594 bp的帶有同源臂的AvBD6序列全長（AvBD6HA），擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段。以pPG612 為模板，pPG612F/R 為引物，擴增5 050 bp的pPG612 全長序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA 凝膠回收試劑盒回收后按照One Step Cloning Kit 說明與AvBD6HA序列進行同源重組，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPG612-AvBD6HA。采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至乳酸乳球菌NZ3900 感受態(tài)細胞中，構(gòu)建重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900。取重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 的培養(yǎng)物為模板，設(shè)置陰性對照（乳酸乳球菌NZ3900）和空白對照，利用引物tAvBD6-F/R PCR鑒定并由庫美科技生物有限公司測序。

1.6 重組蛋白AvBD6（rAvBD6）的表達與鑒定 將重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 及陰性對照菌株（乳酸乳球菌NZ3900）培養(yǎng)至OD600nm=0.4～0.5 時，加入終濃度為50 ng/mL 的Nisin，30 ℃靜止誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h～7 h，5 000 r/min 離心10 min 分離菌體和培養(yǎng)上清。利用PBS 稀釋菌體OD600nm值（光密度）為2 后超聲破碎，12000 r/min，離心10 min，上清經(jīng)0.45 μm 濾器過濾后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。以HA MAb（1 5 000）為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1 10 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定上清液中rAvBD6 的表達，并利用BCA 法對重組蛋白進行絕對定量。

1.7 rAvBD6刺激雞外周血單個核細胞（PBMCs）細胞因子的檢測 采集6周齡～11周齡SPF雞抗凝血，分離出外周血單個核細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，接種于1 mL/孔到24 孔板細胞培養(yǎng)板，在細胞培養(yǎng)板孔中加入50 μL 上述制備的rAvBD6，設(shè)置陰性對照[加入50 μL 的乳酸乳球菌NZ3900 的菌體裂解上清（wt-lactis-control）]，陽性對照[分別加入10 μL 濃度為1 μg/mL 的LPS（LPS）或20 μL 濃度為100 μg/mL的ConA 和濃度為1 μg/mL 的PMA 混合溶液（ConA+PMA）]，每組樣品設(shè)置3 個重復(fù)。將細胞于37 ℃5% CO2培養(yǎng)24 h 后，提取細胞核酸，分別以L-12p70-F/R，IL-10-F/R 為引物，采用SYBY Green Ⅰ熒光定量試劑盒定量檢測培養(yǎng)細胞中IL-12p70 和IL-10 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平[9]。

1.8 rAvBD6刺激雞巨噬細胞系（HD11）細胞因子的檢測 將雞巨噬細胞于24 孔板中培養(yǎng)至1×106個/mL，在細胞培養(yǎng)板孔中加入50 μL rAvBD6，參照1.7 方法設(shè)置陽性對照和陰性對照，每組樣品設(shè)置3 個重復(fù)。將細胞于37 ℃5% CO2培養(yǎng)24 h 后，提取細胞核酸，分別以IL-12p70-F/R，IL-10-F/R 為引物采用SYBY GreenⅠ熒光定量PCR 試劑盒定量檢測細胞中IL-12p70 和IL-10 的mRNA 的轉(zhuǎn) 錄水平。

1.9 rAvBD6 激活報告細胞系J774-DualTMIRF 信號通路的檢測 J774-DualTM細胞是由小鼠J774a.1 巨噬細胞系通過穩(wěn)定整合誘導(dǎo)型報告基因（Lucia 螢光素酶基因）于IRF 干擾素信號通路激活元件中衍生而來的IRF 信號通路激活報告細胞系。該螢光素酶報告基因在ISG54 啟動子的控制下，與5 個IFN 刺激的響應(yīng)元件結(jié)合在一起，該基因編碼的螢光素酶分泌于J774-DualTM細胞上清[10]。本試驗將96 孔板中的J774-DualtmTM細胞培養(yǎng)至2.8×105個/mL，在細胞培養(yǎng)板孔中加入20 μL rAvBD6，參照1.7 設(shè)置陰性對照和陽性對照，每組樣品設(shè)置3個重復(fù)。將細胞于37 ℃5%CO2培養(yǎng)24 h，并收取培養(yǎng)上清，利用微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀（LB 960）檢測培養(yǎng)上清中熒光素酶活性。

1.10 動物實驗驗證rAvBD6 的免疫增強劑活性將10日齡SPF雞隨機分為3組，分別設(shè)實驗組（rAvBD6 100 μL）、PBS 對照組（PBS 100 μL，control），空菌對照組（野生乳酸乳球菌NZ3900 的裂解上清100 μL，wt-lactis-control），分別經(jīng)肌肉注射免疫后兩周采血分離血清，利用ELISA 試劑盒檢測血清中IL-10、IFN-γ 和IL-2 的含量。

1.11 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 進行單因素方差分析，其結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，p<0.001為差異極顯著，p<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 的鑒定 以構(gòu)建的重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900細菌培養(yǎng)液為模板，利用引物tAvBD6-F/R 進行PCR鑒定，結(jié)果顯示，擴增片段大小與預(yù)期相符，陰性對照無目的條帶（圖1），經(jīng)測序鑒定序列正確。表明，正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPG612-AvBD6HA和重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900。

圖1 重組乳酸菌的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 1 Amplification of AvBD6HA fusion gene by PCR

2.2 rAvBD6 的鑒定和定量 重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 經(jīng)Nisin 誘 導(dǎo)后，western blot 鑒定 結(jié)果顯示，rAvBD6 大小約為21 ku，與預(yù)期相符，陰性對照無條帶（圖2）。BSA 法定量結(jié)果顯示，rAvBD6 含量為33 μg/mL。表明AvBD6 在重組乳酸菌pPG612-AvBD6HA/NZ3900 中得到了表達。

圖2 rAvBD6 融合蛋白表達的western blot 鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification of rAvBD6 fusion protein expression by western blot

2.3 rAvBD6 刺激雞外周血單個核細胞產(chǎn)生細胞因子的檢測 利用rAvBD6 刺激雞外周血單個核細胞24 h，采用SYBY Green Ⅰ熒光定量PCR 對細胞中IL-10 和IL-12p70的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平進行定量分析。結(jié)果顯示：rAvBD6 刺激外周血單個核細胞24 h 后，與陽性對照組和陰性對照組相比產(chǎn)生了高水平的IL-10[mRNA轉(zhuǎn)錄水平為76.01，差異極顯著（p<0.0001）（圖3A）]和較高水平的IL-12p70[mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為120.26，差異顯著（p<0.05）（圖3B）]，但IL-10/IL-12p70的比值rAvBD6組與對照組相比差異不顯著（圖3C），表明rAvBD6可以有效激活雞外周血單個核細胞，既能上調(diào)IL-10 的表達進行免疫負調(diào)控，又能上調(diào)12p70 的表達進行免疫激活，表明rAvBD6 刺激雞外周血單個核細胞可以激活免疫應(yīng)答，又能維持免疫穩(wěn)態(tài)。

圖3 rAvBD6 刺激PBMCs 后細胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig. 3 Detection of the transcription levels of cytokines in PBMCs upon rAvBD6 stimulation

2.4 rAvBD6 刺激雞巨噬細胞系細胞因子的檢測rAvBD6 刺激雞巨噬細胞24 h ，采用熒光定量PCR對細胞中IL-10 和IL-12p70 的mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平定量分析結(jié)果顯示，rAvBD6可以刺激雞巨噬細胞產(chǎn)生較高水平IL-10（mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為6.62）、IL-12p70（mRNA 轉(zhuǎn)錄水平為2.28），并且與陽性對照組差異顯著（*：p<0.05）（圖4A、4B）；rAvBD6刺激雞巨噬細胞IL-10/IL-12p70的比值與陽性對照組和陰性對照組相比差異顯著（p<0.05）（圖4C）。表明rAvBD6 對雞巨噬細胞同時具有免疫激活和免疫調(diào)節(jié)雙重活性。

圖4 rAvBD6 刺激HD11 細胞后細胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果Fig. 4 Detection of the transcription levels of cytokines inHD11 cells upon rAvBD6 stimulation

2.5 rAvBD6 激活報告細胞系J774-DualTM細胞干擾素調(diào)節(jié)信號通路的檢測 通過rAvBD6 刺激J774-DualTM細胞24 h，結(jié)果顯示：rAvBD6 顯著激活報告細胞系J774-DualTM的IRF 信號通路（相對光子數(shù)為19619RLUs），并且與陽性對照組相比差異顯著（p<0.05）（圖5）。結(jié)果表明rAvBD6 可以顯著激活巨噬細胞的IRF信號通路，進一步激活干擾素信號通路。

圖5 rAvBD6 刺激J774-DualTM細胞激活I(lǐng)RF 信號通路Fig. 5 Recombinant protein rAvBD6 activates IRF signaling pathway in J774-DualTM cells

2.6 動物實驗驗證rAvBD6 的免疫增強劑活性 免疫SPF 雞2 周后，ELISA 檢測雞血清中IFN-γ、IL-10 和IL-2 的含量。結(jié)果顯示：注射rAvBD6 兩周后雞血清中IFN-γ（mRNA 表達水平為42.36）、IL-10（mRNA 表達水平為8.28）和IL-2（mRNA 表達水平為58.72）的含量均顯著高于空白對照組和空菌對照組（p<0.05）（圖6）。結(jié)果表明，注射rAvBD6 可以有效激活SPF 雞機體的抗感染免疫應(yīng)答（產(chǎn)生較高水平的IFN-γ 和IL-2，圖6B、6C），激活免疫應(yīng)答的同時又可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的平衡（同時產(chǎn)生較高水平的IL-10，圖6A）。

圖6 免疫兩周后雞血清中細胞因子表達量的檢測結(jié)果Fig. 6 Cytokine expression levels in serum after two weeks of immunization

3 討 論

生物安全和綠色食品安全對未來生物制劑尤其是預(yù)防性生物制劑提出了更高的要求，新型的疫苗、免疫佐劑和免疫增強劑等生物制劑也必須逐步符合綠色食品安全的基本要求。本研究制備了表達重組AvBD 的重組乳酸菌，采用了公認的食品級安全級表達菌株（食品級乳酸乳球菌NZ3900 株）和食品級Nisin 誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，重組蛋白β-防御素6 也是天然AvBD6，并非人工設(shè)計的非天然蛋白，從表達系統(tǒng)到目的蛋白均完全符合綠色食品級安全的要求。AvBD6 是主要存在于天然黏膜系統(tǒng)的天然抗菌肽之一，是一種小的陽離子非糖基化的多肽（更適合于原核表達，無需糖基化），僅存于禽類中，主要分布于氣管、腸道等黏膜組織發(fā)揮抗感染作用，不僅具有廣譜的抗菌活性，還有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性，尤其是在天然免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)方面起重要作用[10]。并且本研究采用的食品級乳酸乳球菌NZ3900株的細胞壁成份以及其核酸均具有一定的天然免疫佐劑活性。因此，在食品安全和生物安全形勢十分嚴峻的今天，構(gòu)建安全和與益生功能相適應(yīng)的免疫佐劑和免疫增強劑的表達系統(tǒng)具有重要意義。

本研究表達的rAvBD6 在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)較高水平的IL-12、IL-2 和IFN-γ，同時又可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IL-10。其中IL-12、IL-2 和IFN-γ 屬于典型的Th1 型細胞因子，主要功能是促進免疫應(yīng)答，促進T、B、NK 和巨噬細胞的發(fā)育和分化，同時抑制免疫調(diào)節(jié)細胞（Treg，主要是免疫負調(diào)控T細胞）發(fā)育和抑制免疫抑制性細胞因子的產(chǎn)生和釋放；而IL-10是典型的Treg 型細胞因子，主要功能是抑制Th1 型免疫應(yīng)答，抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生和釋放，起到免疫負調(diào)節(jié)作用[11]，并且現(xiàn)代免疫學(xué)表明，IL-10 的生物學(xué)作用具有驚人的多面性和兩面性，IL-10 抑制性作用的靶細胞包括胸腺細胞，T 細胞，B 細胞，NK 細胞，單核細胞，巨噬細胞，肥大細胞，中性粒和嗜酸性細胞[12]。而最新的研究結(jié)果表明，IL-10 主要影響單核巨噬細胞：抑制釋放炎癥介質(zhì)，抑制IL-12 的合成，阻礙Th1 免疫反應(yīng)，因此抑制LPS 和IFN-γ導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF 和GMCSF 分泌。因此，IL-10 在天然免疫中是十分重要的調(diào)節(jié)性細胞因子。但是，IL-10 可以增強單核巨噬細胞的吞噬作用，它能增加各種受體表達，這些受體能夠與調(diào)理素或非調(diào)理素結(jié)合的病原微生物相結(jié)合并攝入細胞，IL-10 刺激的單核細胞還能夠增強IgG-Fc 受體表達（CD64、CD32、CD16），并且CD14樣分子的表達也會增加，這些分子在細胞攝取非調(diào)理素結(jié)合物質(zhì)中有重要的作用[13-14]。并且，IL-10 同時具有免疫刺激作用，研究發(fā)現(xiàn)，它又能增強抗炎性因子釋放，如增強IL-1 受體拮抗劑和溶解性TNF-α 受體的釋放；IL-10 還能夠在體外提高小鼠脾臟來源B 細胞的存活率，促進B 細胞表面MHCⅡ類分子的表達，促進已激活的B 細胞增殖并分化成為漿細胞，促進IgG1 和IgG3 的類別轉(zhuǎn)換[14]。相關(guān)機制分析發(fā)現(xiàn)，IL-10 的這種作用很可能由DC 或巨噬細胞介導(dǎo)，通過促進表達CXCL-13 及SLAM 來招募、激活B 細胞[14]。因此，IL-10 是抗炎因子，又是免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，rAvBD6 可以同時誘導(dǎo)雞外周血單個核細胞中促炎性細胞因子IL-12、IFN-γ 和抗炎性細胞因子IL-10 的表達；同時誘導(dǎo)雞巨噬細胞中促炎性細胞因子IL-12 和抗炎性細胞因子IL-10 的表達。巨噬細胞是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的主要免疫細胞，研究者可以從外周血單個核細胞中分離單核細胞，誘導(dǎo)成巨噬細胞進行相關(guān)研究[15]。本研究動物實驗中也發(fā)現(xiàn)注射rAvBD6 兩周后可同時激活SPF 雞誘導(dǎo)其產(chǎn)生高水平的IL-10、IL-2 和IFN-γ。說明rAvBD6 可激活機體免疫應(yīng)答的同時又能維持免疫調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)，這與現(xiàn)代免疫調(diào)節(jié)的理念和最新研究結(jié)果相一致。本研究驗證了rAvBD6 作為免疫增強劑的潛力，rAvBD6 即可提高免疫應(yīng)答，又可維持免疫穩(wěn)態(tài)，因此為天然免疫增強劑的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

免疫增強劑是單獨使用就可激活免疫系統(tǒng)和提高免疫應(yīng)答能力，是增強機體特異性和非特異性免疫功能的制劑；而免疫佐劑是必須與抗原結(jié)合使用，才可提高抗原的免疫應(yīng)答水平的制劑。本研究制備的rAvBD6 單獨使用可激活機體誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IL-10、IL-2 和IFN-γ，并且驗證了其在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)活性的一致性，即激活免疫應(yīng)答的同時又能維持免疫穩(wěn)態(tài)。因此，本研究表達的rAvBD6 有望成為一種新型的、有潛力的天然免疫佐劑或免疫增強劑。本研究為重組禽防御素作為疫苗佐劑和免疫增強劑的研究提供了實驗依據(jù)，對新型免疫佐劑或免疫增強劑的開發(fā)具有重大意義。