王小茹，閆 鶴

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

豬非典型瘟病毒（Atypical porcine pestivirus，AP?PV）是一種無囊膜、單股RNA 病毒，屬于黃病毒科（Flavivridea）瘟病毒屬（Pestivirus）成員[1]。APPV 基因組全長10.8 kb～11.5 kb，包含一個(gè)開放閱讀框（Open read frame，ORF），編碼病毒的多聚蛋白，包括4 個(gè)結(jié) 構(gòu) 蛋 白（C、Erns、E1 和E2）和8 個(gè) 非 結(jié) 構(gòu) 蛋 白（Npro、 P7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A 和NS5B）[1]。2015 年，Hause 等利用宏基因 組 測 序 技術(shù)，首次在豬呼吸與繁殖綜合征病毒陽性豬血清樣品中發(fā)現(xiàn)APPV[2]。隨后，Arruda 等[3]和Groof 等[4]通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)APPV 可以引起仔豬先天性震顫（Congenital tremors，CT）。APPV 作 為一種新發(fā)病原，不僅可以在CT 病豬中檢出，其還可以引起豬的隱性和持續(xù)性感染，導(dǎo)致豬群反復(fù)出現(xiàn)CT 病癥[2,4-5]。迄今，APPV 已在4 大洲15 個(gè)國家被報(bào)道[1]，該病毒與CT 高度相關(guān)，是全球養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)新威脅。

目前，APPV 在我國出現(xiàn)新的變異，廣東、江西和安徽出現(xiàn)新基因型APPV[6-7]。本研究于2017 年～2018 年采集兩廣地區(qū)兩個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場10 份CT 病料樣品進(jìn)行APPV 檢測，采用RT-PCR 方法擴(kuò)增了其中3 份APPV 陽性病料樣品的ORF 基因序列，并分析了其與GenBank 中登錄的60 株APPV 的ORF、E2和P7 基因序列的同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系，為揭示APPV 在中國的流行情況及其基因多樣性，以及后續(xù)對該病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 10 頭患有CT 的仔豬病料樣品（每頭豬都采集了腦、肺、心臟、腎、脾和淋巴結(jié)樣品）于2017 年～2018 年采自兩廣地區(qū)2 個(gè)規(guī)模化豬場，病豬臨床表現(xiàn)為全身震顫、行走困難、無法吮吸初乳。PBS 緩沖液（pH 7.4）購自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 購自QIAGEN 公 司；One-step RT-PCR kit、pMD19-T 載體、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker 和Mini?BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0 購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司。

1.2 病料樣品檢測與APPV ORF 基因的RT-PCR擴(kuò)增及測序 將每頭豬的所有組織樣品剪取0.5 g 混合后加入PBS 緩沖液，研磨、離心后取上清液，按照試劑盒說明書提取總RNA。以各病料樣品提取的RNA 為模板，利用APPV 檢測引物[6]，按照One-step RT-PCR kit 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。選取陽性樣品，參考文獻(xiàn)[6]采用10對引物分段擴(kuò)增APPV的ORF基因序列[6]。PCR 產(chǎn)物由華大基因測序，利用DNAStar 7.1軟件拼接后獲得APPV ORF全長基因序列。

1.3 APPV ORF 基因及其包含的E2 和P7 基因序列的同源性及遺傳演化分析 利用DNA Star7.1 軟件，將本研究中的3 株APPV 的ORF 基因及ORF 基因包含的E2 和P7 基因序列與GenBank 登錄的60 株國內(nèi)外APPV 參考株相應(yīng)基因序列進(jìn)行同源性分析，采用MEGA7.0 軟件（Neighbor-Joining method，bootstrap值為1 000）軟件構(gòu)建該3 種基因的遺傳進(jìn)化樹，分析APPV 的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 病料樣品與APPV ORF 基因的RT-PCR 擴(kuò)增、測序結(jié)果 利用APPV 檢測引物對兩廣地區(qū)2 個(gè)豬場的10 份病料樣品進(jìn)行APPV RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示10 份樣品均為APPV 陽性。從上述10 份AP?PV 陽性樣品中選出3 份，采用RT-PCR 分段擴(kuò)增經(jīng)拼接后獲得3 株APPV 的ORF 全長基因序列，長度均為10 908 bp，編碼3 635 個(gè)氨基酸。來源于廣西豬場的2 株APPV 分別命名為GX-GL1 和GX-GL67，來源于廣東豬場的1 株APPV 命名為GD-CT4，3 株APPV 的ORF 基因序列上傳至GenBank，獲得登錄號分別為MN584738、MN584739 和MN584737。

2.2 APPV ORF 基因及其編碼氨基酸序列的同源性及遺傳演化分析結(jié)果 利用DNAStar 7.1 軟件對AP?PV 的ORF 基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，3 株APPV 之間的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為81.6%～99.8%和91.4%～99.9%；與41 株中國參考株的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為80.8%～99.3%和90.5%～99.6%；與19 株國外參考株的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為81.3%～91.1%和90.8%～96.3%。GX-GL1株、GX-GL67株均與廣西GX01 株（MH715893）和貴州GZ01 株（KY475592）的同源性最高（核苷酸序列同源性分別為98.6%、98.5%；氨基酸序列同源性均為99.3%）；GD-CT4株與廣東GD-MH01 株（MH493894）同源性最高（核苷酸序列同源性為99.3%，氨基酸序列同源性為99.6%）。結(jié)果表明，本研究獲得的3 株APPV 均與中國參考株的同源性最高。

ORF 基因的進(jìn)化樹結(jié)果顯示，APPV 分為3 種基因型，與近期的其它研究結(jié)果一致[6-7]。GX-GL1株和GX-GL67 株屬于基因1 型，與基因1 型貴州GZ01 株（KY475592）同屬于一個(gè)分支且親緣關(guān)系最近；而GDCT4 株屬于基因3 型，與基因3 型廣東GD-MH01 株（MH493894）聚為一個(gè)分支（圖1）。廣西有基因1型AP?PV流行，而廣東3 種基因型的APPV 均有流行[6]。從地理分布來看，基因1型APPV分布最廣泛，在中國及其它6個(gè)國家（奧地利、德國、荷蘭、韓國、瑞士、美國）均有流行，而基因2型和3型APPV僅出現(xiàn)在中國；從發(fā)現(xiàn)時(shí)間來看，基因1型APPV可追溯至2006年，基因2 型APPV 可追溯至2016 年，基因3 型APPV 最早出現(xiàn)在2017 年?？梢夾PPV 在世界各國的豬群中均有傳播并不斷進(jìn)化，但在中國APPV卻呈現(xiàn)出多樣性。

2.3 APPV E2 和P7 基因的同源性及遺傳演化分析結(jié)果 E2 基因編碼APPV 主要保護(hù)性抗原蛋白[2]。E2基因與其編碼的氨基酸序列同源性分析顯示，GXGL1株和GX-GL67株均與云南SWU-YB株（MH499646）的同源性最高（核苷酸序列同源性98.5%，氨基酸序列同源性98.3%），與安徽AH-SG-2018.01 株（MK216751）同源性最低（核苷酸序列同源性80.8%，氨基酸序列同源性88.4%）；與國外參考株核苷酸序列的同源性為87.1%～91.7%，氨基酸（MH493894）同源性為89.2%～95%。GD-CT4 株與廣東GD-MH01 株（MH493894）和GD-BZ01 株（MH493896）的E2 基因序列同源性最高（核苷酸和氨基酸序列同源性均為100%），與外國參考株中的德國GER-01 株（LT594521）同源性最高（核苷酸序列同源性82.8%，氨基酸序列同源性92.9%）（圖2A）?？傊?，E2 基因的同源性分析顯示，3 株APPV 均與國內(nèi)APPV 的同源性更高。

P7 基因編碼病毒孔蛋白，該蛋白可以運(yùn)輸離子和其它分子通過宿主細(xì)胞膜，有助于病毒進(jìn)入細(xì)胞及其在細(xì)胞中的成熟[2]。APPV P7 基因的同源性分析結(jié)果顯示，3 株APPV 與60 株參考株的核苷酸序列的同源性為74.5%～100%，氨基酸序列的同源性為61.3%～100%。3 株APPV 均與四川SWU-ZH 株（MH499647）P7 基因氨基酸序列同源性最低（<70%）（圖2B）。豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CS?FV）的P7 蛋白與毒力相關(guān)[8]，APPV 的P7 蛋白變異是否會(huì)影響APPV 的毒力還需進(jìn)一步研究。

圖1 APPV ORF 基因的遺傳進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on ORF gene sequences of APPV

為了進(jìn)一步確定經(jīng)ORF 基因鑒定的APPV 的基因分型結(jié)果，本研究對APPV 的E2 和P7 基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。E2 和P7 基因的遺傳進(jìn)化樹結(jié)果均顯示，GX-GL1 株和GX-GL67 株屬于基因1 型且與基因1 型的2 株廣西株（MH715893、KY652092）、1 株四川株（MH499645）、1 株云南株（MH499646）和1 株貴州株（KY475592）聚為一個(gè)分支；而GD-CT4 株屬于基因3 型，與基因3 型的3 株廣東株（MH493894、MH493895、MH493896）聚為一個(gè)分支。63 株APPV在E2 和P7 基因的遺傳進(jìn)化樹中的分型結(jié)果與ORF基因序列分型結(jié)果基本一致，這表明當(dāng)前所有已鑒定的APPV 可分為3 個(gè)基因型，分別是基因1 型、2型和3 型。

圖2 APPV E2 基因（A）和P7 基因（B）的遺傳進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic trees based on E2 gene (A) and P7 gene (B) of APPV

本研究經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得了3 株APPV 的ORF 基因序列，分析了兩廣地區(qū)的3 株APPV 與GenBank 中登錄的60 株APPV 的ORF、E2 和P7 基因的同源性及遺傳變異與演化特征，對APPV 分子流行病學(xué)監(jiān)測具有重要意義。