鄭新添，林成鴻，馬露露，李曉華，黃翠琴*

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364000；2.福建省生豬疫病防控工程研究中心，福建 龍巖 364000）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，H.parasuis）是一種條件性病原菌，存在于健康豬群上呼吸道，其血清型比較復(fù)雜，已鑒定的至少包含15 個(gè)血清型，尚有15%～20%未能鑒定，國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)主要流行血清4 型和5 型。H. parasuis在應(yīng)激、免疫力低下等條件下，可導(dǎo)致豬感染，引起豬格拉氏病。該病常見(jiàn)于4 周齡～8 周齡豬，發(fā)病率約10%～20%，以纖維性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要病理特征?？股卦谝欢ǔ潭壬夏芸刂艸. parasuis感染，但由于耐藥性和藥物殘留導(dǎo)致的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，極大限制了抗生素的防控效果，因而疫苗免疫仍然是不可或缺的手段[1]。目前臨床使用的H. parasuis疫苗主要為滅活疫苗，但其保護(hù)效果特別是對(duì)不同血清型的交叉保護(hù)不理想。為提高免疫效果，研究者從抗原和免疫佐劑等方面進(jìn)行了探索。近年來(lái)以H. parasuis外膜蛋白如Omp2、Omp5 和D15 等為抗原的疫苗被證實(shí)具有較好的免疫效果，成為近期研究的熱點(diǎn)[2]。由于亞單位疫苗的抗原性相對(duì)較弱，常需要添加佐劑。亞單位疫苗的常規(guī)佐劑有鋁佐劑和弗氏佐劑等。然而，傳統(tǒng)的含油類佐劑會(huì)產(chǎn)生免疫副反應(yīng)，如肉芽腫、潰瘍、發(fā)熱等[3]。

生物可降解材料，如聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、海藻酸、殼聚糖等，制備的微球載體作為蛋白抗原投遞系統(tǒng)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[4]。微球載體不僅能保護(hù)抗原在體內(nèi)免受不適境破壞，還具有緩釋抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)等作用，已成為一種理想的抗原佐劑[4]。此外，微球疫苗還可以節(jié)約抗原，減少接種次數(shù)從而減輕疼痛等，備受研究者關(guān)注。PLGA 是經(jīng)美國(guó)FDA 認(rèn)證可降解和具有良好生物相容性的材料。PLGA 微球具有保護(hù)藥物、抗原等免受環(huán)境破壞，可以控制藥物和抗原緩釋，降低藥物毒性和刺激性等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥物和疫苗的研發(fā)領(lǐng)域[5]。

為提高H. parasuis疫苗的免疫效果，本研究以H. parasuis外膜蛋白Omp16 為芯材，以PLGA 為壁材制備了H. parasuis微球疫苗；對(duì)微球的生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定，并以小鼠為模型評(píng)估微球疫苗的免疫效果，以期為開(kāi)發(fā)H. parasuis新型亞單位疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料H. parasuisLY02 株（血清5 型）及其外膜蛋白Omp16[6]均由福建省生豬疫病防控工程研究中心保存；KM 小鼠購(gòu)自閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司。聚乳酸聚羥基乙酸（PLGA，LA/GA 摩爾比為50 50，分子量15 ku～24 ku，黏度為0.18～0.25）購(gòu)自濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，聚乙烯醇（PVA）、胎牛血清、透析袋（截留分子質(zhì)量為25 ku）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 微球制備 采用W/O/W 復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備PLGA 微球。將0.33 g PLGA 溶解于10 mL 二氯甲烷中，將1 mgH. parasuisOmp16 蛋白溶解于1 mL PBS（pH 7.4, 10 mmol/L），800 r/min 攪拌5 min 形成初乳。向初乳溶液中加入50 mL 含2%（wt%）的PVA 水溶液，800 r/min 攪拌5 min，得到W/O/W 復(fù)乳溶液。再將復(fù)乳溶液倒入100 mL 0.3% PVA 水溶液中，室溫下1 000 r/min 攪拌3 h，蒸干二氯甲烷。2 500 r/min 離心10 min，收集微球，再用超純水離心洗滌3 次，將微球制成一定濃度懸液，冷凍干燥72 h，收集微球凍干粉，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微球形態(tài)觀察和粒徑測(cè)定 取少量微球分散于蒸餾水中，取一滴涂布于載玻片，置光學(xué)顯微鏡觀察。將微球分散于去離子水中，取1 mL 懸浮液置于Microtrac S3500 儀樣品池中，進(jìn)行粒徑分布測(cè)定。

1.4 微球的包封率和載藥量的測(cè)定 參照Borges 等方法[7]，測(cè)定微球的包封率和載藥量。先采用BCA試劑盒測(cè)定包封前溶液的蛋白量，包被結(jié)束后，取1.0 mL 微球懸液，12 000 r/min 離心15 min，再次使用BCA 試劑盒測(cè)定上清中的蛋白量，根據(jù)以下公式1 和公式2 分別計(jì)算微球的包封率和載藥率：

公式1 包封率=（包封前蛋白量-上清液中的蛋白量）/包封前蛋白量×100%。

公式2 載藥率=（加入蛋白的總質(zhì)量-上清液中蛋白質(zhì)量）/干燥微球的質(zhì)量×100%。

1.5 微球的體外釋放試驗(yàn) 采用透析釋藥法測(cè)定微球的體外釋放特性。稱取微球100 mg，置于透析袋中，樣品中加入10.0 mL 釋放緩沖液（100 mmol/L so?dium phosphate，9.1 mmol/L NaCl，0.01 wt% Tween 80，0.02 wt% NaN3，pH 7.4），用棉繩扎緊封口，放入15 mL 離心管中，于空氣浴恒溫振蕩器（37 ℃，110 r/min）中進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)。按照預(yù)定的時(shí)間間隔（0.5 d、1 d、2 d、6 d、12 d、18 d、24 d、30 d、36 d和42 d）取出離心管，8 000 r/min，離心5 min，取

1.0 mL 釋放介質(zhì)于已經(jīng)編號(hào)的小樣品管中，待測(cè)。取樣完后繼續(xù)補(bǔ)加1.0 mL 新鮮的釋放緩沖液，放入空氣浴恒溫振蕩器中繼續(xù)釋放。取出的釋放液中的抗原含量用BCA 法作定量檢測(cè)，計(jì)算累積釋放量（按照公式3 計(jì)算）。以釋放時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積釋放率（按照公式4 計(jì)算）為縱坐標(biāo)，繪制微球在釋放介質(zhì)中抗原的釋放曲線。

公式3：Q=Cn×Vt+Vs∑Cn-1

Q：抗原累積釋放量（μg），Cn：t 時(shí)刻取出釋放液的濃度（μg/mL），

Vt：釋放介質(zhì)體積（mL）， Vs：每次取出釋放介質(zhì)體積（mL）。

公式4：累積釋放率=Qt/Qa×100%

Qt為t 時(shí)刻累積釋放量，Qa為微球載抗原蛋白總量，即Qa=微球質(zhì)量×微球載藥率

1.6 小鼠免疫試驗(yàn) 將40 只健康KM 小鼠隨機(jī)分成4 組，分別免疫PLGA 微球疫苗、PLGA 空載微球（即制備過(guò)程中不添加抗原蛋白）、H. parasuis滅活疫苗[8]和生理鹽水。小鼠通過(guò)皮下注射接種，14 d 后加強(qiáng)免疫1 次，免疫劑量和免疫途徑同首次免疫（表1）。分別在接種前、首次免疫后二周（14 d.p.i）和再次免疫后二周（28 d.p.i）采集小鼠眼眶后靜脈叢血液，分離血清，采用ELISA 法測(cè)定血清抗H. parasuisIgG 抗體滴度[9]。將血清作1 80 稀釋后，按100 μL/孔加入H. parasuis抗體ELISA 檢測(cè)反應(yīng)板（預(yù)包被H. parasuisOmp16 蛋白抗原1 μg/mL），置37 ℃孵育40 min。洗板3 次后，加入1 10 000 稀釋的HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG，100 μL/孔，置37 ℃孵育30 min。洗板3 次，加入底物TMB，100 μL/孔，37 ℃避光顯色10 min。加終止液2 mol/L H2SO4，50 μL/孔，混勻。終止反應(yīng)后10 min 內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450nm值。

1.7 小鼠攻毒試驗(yàn) 再次免疫后15 d（首免后29 d）后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每只小鼠腹腔接種4.0 × 109cfu（2 × LD50）H. parasuisLY02 株。記錄攻毒后小鼠的臨床癥狀，發(fā)病和死亡情況，共觀察7 d，未死亡的小鼠迫殺，取剖檢小鼠的肺、肝和脾組織進(jìn)行H. parasuis的PCR 檢測(cè)[10]。

表1 動(dòng)物分組及免疫劑量Table 1 Animal grouping and immune dose

2 結(jié) 果

2.1 微球的形態(tài)、粒徑分布及微球的包封率和載藥率 通過(guò)復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備了PLGA 微球，在光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，制備的PLGA 微球呈球性，表面圓整，分散良好（圖1）。激光粒徑測(cè)定分析顯示，微球粒徑分布較窄（圖2），平均粒徑為5.2 μm。表明制備的微球具有典型的PLGA 微球特征、良好的分散性和較為均一的粒徑分布。為評(píng)估微球包封效率，通過(guò)BCA 法測(cè)定了制備前Omp16 蛋白總量及包封后溶液上清蛋白含量，根據(jù)公式1 和公式2 計(jì)算得出，在本次制備條件下微球的包封率和載藥率分別為70.5%和5.78%。

圖1 微球的形態(tài)學(xué)觀察（40×）Fig. 1 Microspheres observed under an optical microscope

圖2 微球的粒徑分布圖Fig. 2 Particle size distribution of microspheres

2.2 微球體外釋放試驗(yàn)結(jié)果 為評(píng)估微球的緩釋效果，采用透析釋藥法測(cè)定微球的釋放特性。結(jié)果顯示，包被于微球的抗原蛋白Omp16 在12 h 內(nèi)釋放20%，而第2 d 開(kāi)始，釋放速率下降，至42 d 累積釋放率達(dá)到95.3%（圖3）。表明微球在體外PBS 溶液中緩釋效果較好。

圖3 微球的體外釋放曲線Fig. 3 In vitro release profile of encapsulated Omp16 from PLGA microspheres

2.3 小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果 為評(píng)估微球疫苗的免疫效果，以小鼠為模型進(jìn)行了免疫接種試驗(yàn)，即小鼠分別接種H. parasuis微球疫苗、空載微球和H. parasuis滅活疫苗，空白對(duì)照組接種生理鹽水。以相同劑量接種兩次，中間間隔14 d。ELISA 檢測(cè)抗體結(jié)果顯示，疫苗組（A 組和C 組）均產(chǎn)生H. parasuis抗體，而對(duì)照組（B 組和D 組）則未檢測(cè)到H. parasuis抗體。微球疫苗組小鼠在首次免疫后二周（14 d.p.i）抗體水平顯著低于滅活疫苗組（p<0.05），然而在加強(qiáng)免疫后二周即首次免疫后28 d（28 d.p.i），微球疫苗組小鼠抗體水平極顯著高于滅活苗組（p<0.01）（圖4）。結(jié)果表明，PLGA 微球顯著促進(jìn)了Omp16 抗原刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答水平。

圖4 各組小鼠抗副豬嗜血桿菌IgG 抗體水平的檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 IgG levels of mice after immunization

2.4 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果 最后一次免疫15 d 后，各組小鼠以腹腔注射方式攻毒2 LD50的血清5 型H. parasuisLY02 株，結(jié)果顯示，空白微球組和生理鹽水對(duì)照組小鼠主要表現(xiàn)為精神沉郁，食欲下降，被毛粗亂，體溫升高（39.6 ℃～40.5 ℃），在攻毒24 h內(nèi)這兩組所有小鼠均死亡，經(jīng)PCR 檢測(cè)在死亡小鼠脾臟和肺等組織檢出H. parasuis。而微球疫苗組小鼠在攻毒后，食欲下降，部分小鼠體溫升高至

39.5 ℃～40.0 ℃后恢復(fù)正常；滅活疫苗組小鼠主要表現(xiàn)為精神沉郁，部分小鼠體溫升高至39.5 ℃～40.0 ℃，食欲下降及被毛粗亂。在觀察期內(nèi)（攻毒后7 d），微球疫苗組對(duì)小鼠的保護(hù)率為81.8%（9/11），顯著高于滅活疫苗組的保護(hù)率63.6%（7/11）（p<0.05）。上述結(jié)果表明，微球疫苗顯著提高了小鼠的攻毒保護(hù)率。

3 討 論

微球的制備方法包括相分離法、噴霧干燥法、復(fù)乳溶劑揮發(fā)法和超臨界流體激素等，其中復(fù)乳法的設(shè)備要求簡(jiǎn)單，操作較為簡(jiǎn)便，制備條件相對(duì)溫和，可較大限度避免抗原在制備過(guò)程中遭受破壞，是目前最常用的方法之一?；诖耍狙芯窟x用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備PLGA 微球。

微球的粒徑大小影響微球疫苗誘導(dǎo)的免疫類型。研究報(bào)道表明，小于10 μm 的微球能被吞噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞識(shí)別和吞噬，從而刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)[11]。微球不僅能刺激體液免疫反應(yīng)，也能刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)，微米級(jí)微球偏向于激活體液免疫，而納米級(jí)微球有利于激活細(xì)胞免疫[12]。本研究制備的PLGA 微球粒徑約5.2 μm，誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，這也與其粒徑有關(guān)。

微球的粒徑分布與其制備參數(shù)密切相關(guān)。表面活性劑的種類和濃度、PLGA 濃度、油水相體積比及混合速度等均可影響微球粒徑。本研究制備的微球粒徑分布，獲得了一個(gè)相對(duì)較窄的峰，說(shuō)明其粒徑相對(duì)比較均一。然而，機(jī)械攪拌乳化法盡管設(shè)備簡(jiǎn)單，但是采用該方法制備的微球粒徑均一性較差，通過(guò)膜乳化法可以獲得粒徑均一性較好的微球。

抗原的包封率和載藥率是影響微球疫苗免疫效果的主要因素之一。本研究制備的微球疫苗包封率為70.5%，載藥率為5.78%。影響微球包封率和載藥率的因素包括抗原濃度、粒徑大小和制備工藝參數(shù)（如攪拌速度、體系溫度和攪拌時(shí)間）等。由此，若進(jìn)一步優(yōu)化微球制備工藝，將進(jìn)一步提高微球疫苗的包封率和載藥率，從而可進(jìn)行單次接種免疫，節(jié)約抗原用量，節(jié)省成本。

為了評(píng)估微球疫苗的緩釋效果，進(jìn)行了微球的體外抗原釋放試驗(yàn)。結(jié)果顯示，微球疫苗釋放動(dòng)力曲線符合雙相動(dòng)力模型，在開(kāi)始12 h 抗原釋放速率較快，隨后釋放速度下降，最終微球釋放時(shí)間持續(xù)42 d，累計(jì)釋放95.3%，說(shuō)明微球具有良好的緩釋效果，這與微球疫苗免疫后小鼠獲得更高滴度的抗體水平相吻合。與滅活疫苗組相比，微球疫苗組小鼠在免疫后14 d 抗體水平低于滅活疫苗疫苗組，而在免疫后28 d 則顯著高于滅活疫苗組，其原因是微球疫苗抗原是逐漸釋放的，在早期抗原濃度低于滅活疫苗抗原，因此在免疫后14 d 抗體水平低于滅活疫苗組；而隨著微球疫苗釋放的抗原濃度逐漸增加，抗體水平也持續(xù)增加，在28 d.p.i 抗體水平顯著高于滅活疫苗組。

脈沖式釋放藥物或抗原是微球疫苗的特征之一。PLGA 微球釋放抗原可對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)持續(xù)刺激，從而為其產(chǎn)生長(zhǎng)久堅(jiān)固免疫力提供可能。由于微球呈非均一性降解，抗原從微球釋放的曲線通常是二相或三相[13]。第一階段通常是抗原突釋，即釋放速度快，主要原因是吸附于微球表面的抗原釋放或/和抗原從微球空隙及制備過(guò)程中微球的崩解。PLGA 自身的物理性質(zhì)如乳酸/羥基乙酸的比例、相對(duì)分子質(zhì)量、微球表面形態(tài)、粒徑大小、環(huán)境溫度等因素直接影響到PLGA 的降解速率，從而影響微球內(nèi)藥物的釋放性能[14]。由于微球性質(zhì)的差異（如壁材、芯材成分及制備方法不同），微球疫苗的緩釋時(shí)間可從數(shù)天、數(shù)星期甚至一個(gè)月以上不等[15]。

體液免疫是豬抵抗副豬嗜血桿菌的主要感染機(jī)制，本研究顯示PLGA 微球投遞載體顯著提高了IgG抗體水平，免疫小鼠獲得了較高的保護(hù)率。此外，微球疫苗還可能誘導(dǎo)了小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答，與體液免疫共同抵抗H. parasuisLY02 株的感染?？傊狙芯砍醪街苽淞税釮. parasuis外膜蛋白Omp16 的PLGA 微球，并證實(shí)微球佐劑能提高抗原的免疫效果，為PLGA 微球成為H. parasuis亞單位疫苗候選佐劑提供了有力佐證。