成溫玉，趙鴻遠(yuǎn)，權(quán)群學(xué)

（安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000）

豬腹瀉病一直是困擾我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的一大難題，對(duì)于引起仔豬腹瀉病原體的研究更是一大熱點(diǎn)。2007 年香港學(xué)者Dong 等在監(jiān)測(cè)我國(guó)南方地區(qū)SARS（Severe acute respiratory syndrome）病毒流行情況時(shí)，通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)在亞洲豹貓和中國(guó)白鼬獾的糞便中鑒定到一種新的冠狀病毒[1]。隨后Woo 等在對(duì)香港地區(qū)不同動(dòng)物來(lái)源的樣品開(kāi)展冠狀病毒監(jiān)測(cè)時(shí)，又檢測(cè)到7 種新的冠狀病毒，其中就包括豬δ 冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）[2]。美國(guó)俄亥俄州于2014 年1 月中旬首次在腹瀉仔豬的糞便和小腸中檢測(cè)到PDCoV 的感染，相繼迅速蔓延到其他多個(gè)州，引起養(yǎng)豬業(yè)和獸醫(yī)領(lǐng)域的關(guān)注并開(kāi)展了一系列的疾病篩查工作，隨后我國(guó)大陸也檢測(cè)到該病原的存在[3-5]。目前該病已在美國(guó)、墨西哥、加拿大、泰國(guó)、越南、老撾、韓國(guó)、日本、中國(guó)臺(tái)灣及中國(guó)大陸等地檢出且呈現(xiàn)流行趨勢(shì)[6-12]。與豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）相似，PDCoV 感染可引起豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水等癥狀，仔豬表現(xiàn)出較高的死亡率[13]。更重要的是，PDCoV 常與PEDV 存在共感染的情況，不僅加重了豬群的危害性，也給疾病的診斷和預(yù)防帶來(lái)困難[14]。作為新發(fā)的傳染性豬病，豬δ 冠狀病毒病尚無(wú)商業(yè)化的疫苗和有效的治療手段，加之其廣泛的宿主嗜性，對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生也存在潛在的危害[15]。

1 豬δ 冠狀病毒的生物學(xué)特性

1.1 理化特性 PDCoV 屬于δ 冠狀病毒屬（Delta?coronavirus），在目前發(fā)現(xiàn)的幾種δ 冠狀病毒中，其最為常見(jiàn)且危害最大[6,14]。與PEDV 相似，PDCoV 表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境抵抗力。研究顯示，PDCoV 在50 ℃孵育60 min 或者60 ℃孵育30 min 才可被滅活；同時(shí)該病毒對(duì)酸較為敏感，在pH=3.0 的環(huán)境中，病毒容易失活；然而，PDCoV 對(duì)脂溶性溶劑（氯仿和乙醚）不敏感，無(wú)論是4.8%氯仿溶液還是20%乙醚溶液，對(duì)病毒的活性影響不顯著[16]。有關(guān)PDCoV 在飼料原料各成分中存活情況的研究發(fā)現(xiàn)，病毒在豆粕中維持感染力長(zhǎng)達(dá)56 d，在其他飼料原料中也會(huì)存活至少42 d[17]。而飼料中的鹽、磷酸、檸檬酸和延胡索酸等添加劑有助于滅活飼料中存在的病毒粒子，但不能完全使病毒粒子失活[18]。同時(shí)這些添加劑在廠家提供的參考劑量下對(duì)PDCoV 不具殺滅活性，而當(dāng)其劑量達(dá)到廠家提供參考劑量的二倍且儲(chǔ)存10 d 以上時(shí)，才使得大部分病毒粒子失活[18]。因此這些研究表明，PDCoV 對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗能力。

1.2 分離與培養(yǎng)特性 盡管2012 年就已證實(shí)PD?CoV 的存在，然而直到2014 年6 月才由美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)Ma 等分離到病毒粒子[4]。國(guó)內(nèi)首株P(guān)DCoV（NH 株）由哈爾濱獸醫(yī)研究所馮力團(tuán)隊(duì)于2015 年分離獲得[19]。PDCoV 的細(xì)胞嗜性廣泛，能有效地感染豬睪丸細(xì)胞（ST）、豬腎上皮細(xì)胞（LLC-PK1）、豬腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2 和IPI-2I）、豬腎細(xì)胞（PKFA 和PK15）、豬腎上皮細(xì)胞（SK6）、豬甲狀腺細(xì)胞系（PD5）、雞肝癌細(xì)胞（LMH）、雞成纖維細(xì)胞（DF-1）、人肝癌細(xì)胞（Huh7）、人肺癌細(xì)胞（A549）、HeLa 細(xì)胞和人結(jié)直腸癌細(xì)胞（HRT-18）等細(xì)胞系以及雞胚[15,20-21]，但只有ST 和LLC-PK1 是目前發(fā)現(xiàn)最佳的病毒分離和傳代的細(xì)胞模型[22]。在分離和傳代過(guò)程中，需在培養(yǎng)基中添加10 μg/mL 的胰酶、1%的胰腺酶或小腸內(nèi)容物（SIC）才能保證細(xì)胞病變（Cytopathic effect，CPE）的產(chǎn)生。用腹瀉豬的糞便、小腸內(nèi)容物或者組織樣品孵育這兩種細(xì)胞后，細(xì)胞先是表現(xiàn)出變大、變圓和聚集，隨后皺縮并脫落并出現(xiàn)凋亡性壞死[23]。盡管PDCoV 主要感染活體豬的腸細(xì)胞，但卻對(duì)體外培養(yǎng)的小腸上皮細(xì)胞（IPECJ2）易感性差，Jung 等向IPEC-J2 接種在LLC-PK 細(xì)胞上適應(yīng)后較高劑量的PDCoV 時(shí)，培養(yǎng)3 代后細(xì)胞才出現(xiàn)CPE，且在此過(guò)程中也需要往培養(yǎng)基中添加10 μg/mL 的胰酶[22]。上述在病毒分離培養(yǎng)時(shí)添加胰酶或SIC 表明胰酶在病原的生命周期中起到重要作用，而最近的研究也證實(shí)胰酶促進(jìn)PDCoV 的侵入，胰酶激活PDCoV 棘突蛋白S，激發(fā)宿主細(xì)胞融合，從而促進(jìn)病毒粒子依賴于細(xì)胞表面受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[24]。此外，PDCoV 還可依賴于內(nèi)體中組織蛋白酶B 和L 的內(nèi)吞途徑侵入，但胰酶誘導(dǎo)的細(xì)胞膜表面侵入途徑起到主要作用[24]。另外，近來(lái)以干細(xì)胞技術(shù)建立的腸小體（Enteroids）被認(rèn)為是模擬豬的腸道結(jié)構(gòu)和功能、研究腸道病原的理想模型，已在PEDV 的感染研究中得到證實(shí)[25]，但PDCoV 是否能成功感染有待研究。

從自然感染的樣品中分離病毒時(shí)，第一代細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)CPE，一般傳至第3 代時(shí)可出現(xiàn)局部的CPE，且隨著代次的增加CPE 數(shù)增多，細(xì)胞出現(xiàn)病變的時(shí)間也逐漸縮短。Zhang 等在對(duì)一株P(guān)DCoV 連續(xù)傳代時(shí)發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)胞的病變最早出現(xiàn)在病毒接種后的8 h，并在20 h 后達(dá)到峰值[26]。有關(guān)病毒復(fù)制的研究顯示，PDCoV 的一個(gè)復(fù)制周期需5 h～6 h[27]。起初，病毒粒子通過(guò)其表面的S 蛋白與細(xì)胞上的受體特異性結(jié)合，引起細(xì)胞膜的構(gòu)象改變，以細(xì)胞內(nèi)吞的形式進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，隨后利用宿主細(xì)胞的復(fù)制系統(tǒng)以及病毒自身表達(dá)的蛋白完成復(fù)制[26-27]。

1.3 基因組結(jié)構(gòu)及其功能 與其他冠狀病毒科的成員相似，PDCoV 的基因組為單股正鏈RNA，由9 個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）以5'UTRORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7（NS7a）-3'UTR 為順序組成超過(guò)25 nt 的基因組，共編碼15 個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp2～nsp16）、4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（棘突蛋S、包膜蛋白E、膜蛋白M 和核衣殼蛋白N）和3 個(gè)輔助蛋白（NS6、NS7 和NS7a）[14,26-28]（圖1）。編碼輔助蛋白NS6 的基因位于M 基因和N 基因之間，NS7基因位于N 基因內(nèi)，而NS7a 基因則又是NS7 基因的一部分[27-28]。這些輔助蛋白對(duì)應(yīng)的基因在不同種冠狀病毒之間幾乎沒(méi)有同源性，具有種間特異性[29]。

圖1 PDCoV 的基因組、基因和蛋白示意圖Fig. 1 The genomes, genes and proteins of PDCoV

1.3.1 非結(jié)構(gòu)蛋白 與其他冠狀病毒相似，PDCoV 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒RNA合成（表1）。然而越來(lái)越多的研究證實(shí)，部分非結(jié)構(gòu)蛋白還參與宿主免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)功能。nsp5 是一種3C 樣的蛋白酶，負(fù)責(zé)病毒多聚前體蛋白的成熟加工，屬于冠狀病毒的主蛋白酶[30-31]。除此之外，nsp5 被證實(shí)具有拮抗干擾素信號(hào)通路的能力，其通過(guò)靶向切割I(lǐng) 型干擾素（IFN-I）通路中的關(guān)鍵分子NEMO 和STAT2 破壞IFN-β 和ISGs 的產(chǎn)生，促進(jìn)病毒逃逸宿主的免疫應(yīng)答[30-31]。

表1 PDCoV 編碼蛋白及其已知功能Table 1 The known functions of the PDCoV-encoded proteins

nsp9 是構(gòu)成病毒復(fù)制復(fù)合體重要成員之一，屬于核酸結(jié)合蛋白，能夠結(jié)合ssDNA 和ssRNA，對(duì)于冠狀病毒的復(fù)制至關(guān)重要[32]。其往往依賴于N 端的N-finger 和C 端的GXXXG 結(jié)構(gòu)域形成多種形式的二聚體。這些二聚體增強(qiáng)了nsp9 核酸結(jié)合能力，使得病毒RNAs 在復(fù)制或轉(zhuǎn)錄過(guò)程中更加穩(wěn)定，同時(shí)也保護(hù)病毒RNA 免受核酸酶的降解[32]。

非結(jié)構(gòu)蛋白nsp15 作為一種古老的蛋白，是所有套式病毒目中（Nidovirus）均具有的一種高度保守的內(nèi)切核糖核酸酶，主要參與病毒復(fù)制[33]。在PD?CoV 復(fù)制過(guò)程中，nsp15 以二聚體和單體的形式與nsp8 和nsp12 相互作用參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上病毒復(fù)制復(fù)合體的形成并完成病毒的復(fù)制過(guò)程。另外，nsp15 與PRRSV 的nsp11（二者為同源蛋白）一樣，能夠靶向抑制NF-κB 的激活，進(jìn)而拮抗IFN-β 的產(chǎn)生[34]。鑒于nsp15 的普遍性和保守性，該蛋白可作為Nidovirus 疫苗設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)[33]。其它關(guān)于PDCoV 的非結(jié)構(gòu)蛋白尚未見(jiàn)報(bào)道，然而依據(jù)其在其他相關(guān)冠狀病毒的功能研究可為PDCoV 研究提供借鑒。

1.3.2 結(jié)構(gòu)蛋白 棘突蛋白S 屬于I 型糖蛋白，包含S1 和S2 兩個(gè)亞基且以三聚體的形式存在于病毒粒子表面，決定病毒的宿主范圍和組織噬性[35]。S 蛋白主要通過(guò)與宿主受體蛋白（APN）結(jié)合調(diào)節(jié)病毒粒子侵入宿主細(xì)胞，其中S1 亞基依賴于C 端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，S1-CTD）和N 端結(jié)構(gòu)域（N-ter?minal domain，S1-NTD）參與宿主受體的結(jié)合，而S2亞基則構(gòu)成三聚體棘突蛋白的柄，參與病毒被膜與宿主細(xì)胞膜的融合[35]。S 基因的序列在不同屬的冠狀病毒中表現(xiàn)較大的差異，從而造成不同屬的冠狀病毒形成各自獨(dú)特的血清型，因此，該基因常被用于冠狀病毒進(jìn)化分析[36]。此外，S 蛋白還具有免疫逃逸的功能，S1 亞基三聚體結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[36]。

N 蛋白組成病毒的核衣殼，也參與病毒復(fù)制，主要定位于宿主細(xì)胞胞質(zhì)和核仁[37]。病毒在組裝過(guò)程中，N 蛋白包裹病毒的核酸并通過(guò)自締合的方式形成核糖核蛋白復(fù)合體以幫助病毒組裝，同時(shí)保護(hù)病毒核酸免受胞外物質(zhì)的干擾[38]。N 蛋白在PDCoV逃避宿主免疫監(jiān)視的過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用，通過(guò)干擾豬Riplet 蛋白抑制RIG-I 的激活，同時(shí)阻斷RIG-I 對(duì)dsRNA 的識(shí)別，共同拮抗RIG-I 通路誘導(dǎo)的IFN-I 應(yīng)答[39-40]。此外，研究者們?cè)趯?duì)其他冠狀病毒N 蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，該蛋白還具有分子伴侶和調(diào)控細(xì)胞周期的功能[38]。Lee S 和Lee C 利用2D 電泳探究N 蛋白的功能時(shí)，檢測(cè)到10 個(gè)宿主差異表達(dá)蛋白，其中包括GRP78 和HSC70，表明N 蛋白可能會(huì)誘導(dǎo)宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以及抑制細(xì)胞凋亡，然而PDCoV N 蛋白具體的功能還有待進(jìn)一步探究[37]。包膜蛋白E 分子量較小，主要參與病毒包膜的形成、出芽、成熟以及轉(zhuǎn)運(yùn)。在病毒組裝的過(guò)程中，E 蛋白可與膜蛋白M 形成復(fù)合體，協(xié)助M 蛋白組裝進(jìn)入到病毒的包膜內(nèi)。有關(guān)E 和M 蛋白在病毒復(fù)制中的作用以及免疫調(diào)節(jié)的功能尚缺乏研究[14]。

1.3.3 輔助蛋白 起初，依據(jù)生物信息學(xué)的結(jié)果，僅推測(cè)到PDCoV 編碼NS6 和NS7 兩個(gè)輔助蛋白。而在Fang 等驗(yàn)證其篩選的NS7 單抗時(shí)，檢測(cè)到PDCoV感染的細(xì)胞樣品中存在一條12 ku 特異性蛋白條帶，但在異位表達(dá)NS7 的細(xì)胞中不存在[29]。經(jīng)試驗(yàn)分析和序列對(duì)比證實(shí)，該12 ku 大小的蛋白是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的輔助蛋白，不參與病毒粒子的構(gòu)成，其所對(duì)應(yīng)的基因位于NS7 基因3'端的內(nèi)部[29]。進(jìn)一步對(duì)比不同PDCoV 分離株NS7a 的序列發(fā)現(xiàn)，NS7a 在不同分離株之間存在個(gè)別氨基酸突變，而這一現(xiàn)象與不同毒株間的致病力是否存在聯(lián)系尚未證實(shí)，同時(shí)NS7a 具體功能也缺乏研究[29]。NS6 屬于病毒的早期蛋白，定位于胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，可能參與病毒粒子的組裝。此外，NS6 能夠與RNA 識(shí)別受體RIG-I/MDA5 相互作用降低受體與病毒dsRNA 的結(jié)合，從而抑制RLRs 介導(dǎo)的IFN-β 產(chǎn)生，發(fā)揮免疫抑制的功能[41]。Zhang 等利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的NS6 缺失毒株表明，缺失NS6 后病毒在細(xì)胞和豬體內(nèi)增殖能力降低且對(duì)豬的致病力減弱，因此可作為疫苗設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)[42]。至于NS7 蛋白，病毒缺失后并不影響病毒復(fù)制也不影響病毒毒力，其具體的功能有待深入研究。

2 豬δ 冠狀病毒的流行病學(xué)

2.1 易感動(dòng)物 自從2007 年香港學(xué)者Dong 在野生亞洲豹貓和中國(guó)白鼬首次發(fā)現(xiàn)δ 冠狀病毒以來(lái)，依次又在多種鳥(niǎo)類和豬的體內(nèi)檢測(cè)到δ 冠狀病毒的存在[1-2]。因此，科學(xué)家們推測(cè)鳥(niǎo)類是δ 冠狀病毒的最初宿主，PDCoV 是δ 冠狀病毒在鳥(niǎo)類與哺乳動(dòng)物之間宿主轉(zhuǎn)換的結(jié)果[15,20]。對(duì)此有學(xué)者利用PDCoV 感染雞和火雞發(fā)現(xiàn)，SPF 雞（94 日齡）和火雞對(duì)PDCoV存在易感性[21,43]。PDCoV 不僅在雞胚中可以連續(xù)傳代，而且可引起雞只輕微腹瀉且能在糞便中檢測(cè)到病毒核酸。同時(shí)在感染后17 d 于多個(gè)器官中檢測(cè)到病毒核酸的存在，并且造成肺臟、腎臟以及腸組織輕度的病理?yè)p傷[21]。除了豬和雞感染PDCoV 之外，牛也被證實(shí)能感染PDCoV，但感染具有局限性[44]。無(wú)菌犢牛感染高劑量的PDCoV 后，僅在一段時(shí)間內(nèi)排毒，而不表現(xiàn)任何臨床癥狀和病理變化。進(jìn)一步利用間接免疫熒光證實(shí)，感染動(dòng)物的腸細(xì)胞中存在PDCoV 的特異性抗原，表明牛對(duì)PDCoV 易感，但牛的腸道細(xì)胞尚未完全適應(yīng)該病原[44]。因此，PDCoV這種既感染禽類又感染哺乳動(dòng)物的能力，無(wú)疑具有潛在的公共安全問(wèn)題。

2.2 傳染源和傳播途徑 PDCoV 主要經(jīng)口感染，與

病豬間的接觸和氣溶膠是豬群間水平傳播的主要方式[45]。感染仔豬的糞便和嘔吐物是該病的主要傳染源，一些隱性感染的大齡豬也會(huì)引起其他豬群的感染。另外，被病毒污染的成品飼料、飼料原料、飲水以及運(yùn)輸工具都可成為疾病傳播的重要途徑[16-17]。盡管飼料中的一部原料和添加劑有殺滅病原菌的能力，但當(dāng)其與其他原料成分混合后，這些原料的消毒能力會(huì)被稀釋，而且PDCoV 具有較強(qiáng)的抵抗力。有關(guān)飼料添加劑（鹽、糖、防腐劑、磷酸、檸檬酸和延胡索酸）對(duì)PDCoV 的滅活試驗(yàn)顯示，病毒在含有這些添加劑的飼料中均可存活10 d以上，有的甚至長(zhǎng)達(dá)35 d[17]。此外，有關(guān)感染豬的副產(chǎn)物飼料（肉骨粉、血粉和腸膜蛋白粉）更是病原傳播最危險(xiǎn)的途徑[16-17]。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)和加拿大PEDV 爆發(fā)的初期，一大批含有豬血漿蛋白粉的飼料被檢出含有病毒核酸，并且這些受污染的飼料能夠引起豬群的感染[46]。目前，雖無(wú)感染PDCoV 豬副產(chǎn)物飼料引發(fā)豬群發(fā)病的報(bào)道，但其危害性不容忽視。因此，在購(gòu)買、調(diào)運(yùn)或者引進(jìn)豬只和飼料原料時(shí)，一定要做好病原檢測(cè)，謹(jǐn)防病原傳播。

2.3 流行情況 SARS 的發(fā)生促使人們關(guān)注冠狀病毒，PDCoV 也因此被香港學(xué)者Woo 等于2012 年在豬的腹瀉糞便中檢測(cè)到，且陽(yáng)性達(dá)10.1%（17/169）[2]。隨后，美國(guó)俄亥俄州確認(rèn)該病的存在，經(jīng)基因序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，他們檢測(cè)到的病毒基因組序列與2012 年香港確認(rèn)的PDCoV 具有99%的序列相似性；因此他們推測(cè)美國(guó)的PDCoV 是由中國(guó)引入，而追溯性調(diào)查顯示早在2010 年美國(guó)豬的血清樣品中就存在PDCoV 的抗體[3-4,14]。此后的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全美21 個(gè)州超過(guò)540 個(gè)豬場(chǎng)都存在PDCoV 的感染，陽(yáng)性率為25%[8]。加拿大也于2014 年6 月檢測(cè)到該病原，但流行率較低，學(xué)者對(duì)安大略省2014～2016 年的調(diào)查顯示，PDCoV 在豬群中的感染率為0.1%～1.1%[47]。此外，分子流行病學(xué)調(diào)查顯示墨西哥也存在PDCoV 的感染，陽(yáng)性率達(dá)9.6%（85/885），且高達(dá)54.1%的PDCoV 陽(yáng)性樣品存在與PEDV 共感染的現(xiàn)象[7]。這些數(shù)據(jù)表明PDCoV 在北美地區(qū)流行廣泛，商品豬交易和地理相近可能是造成疫病流行的主要原因。亞洲（中國(guó)、韓國(guó)和日本）和東南亞（泰國(guó)、越南、老撾）國(guó)家PDCoV 的流行也較為普遍，自從2014 年韓國(guó)檢測(cè)到PDCoV 的感染后，不斷有豬群感染該病原的報(bào)道[9-12]。Jang 等檢測(cè)了韓國(guó)2014 年～2016 年來(lái)自449 個(gè)豬場(chǎng)共計(jì)683 份腹瀉樣品，發(fā)現(xiàn)PDCoV 的感染率達(dá)19.03%，且其中有6.3%的樣品混合感染了PEDV[48]。Suzuki 等對(duì)2013 年～2014 年日本的PDCoV 流行情況做了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率達(dá)15.1%，且流行毒株的核苷酸序列與韓國(guó)和美國(guó)的流行株的相似性最高[12]。PDCoV 在我國(guó)流行廣泛，已超過(guò)25 個(gè)省市自治區(qū)報(bào)道存在PDCoV 的流行。Zhang 等對(duì)2016 年～2018 年采集自我國(guó)18 省的豬腹瀉病料的分子檢測(cè)顯示，PEDV 和PDCoV 的感染率分別為36.72%和13.07%，二者混合感染率為4.73%[49]。上述調(diào)查數(shù)據(jù)表明，PDCoV 不但單獨(dú)感染豬只，而且與其它病原混合感染。相比PEDV，盡管PDCoV 感染率略低，引起豬群的危害較低，但與PEDV 及其它病原形成混合感染后既增加了診斷的難度，又使得防控變的更加復(fù)雜。

針對(duì)PDCoV 的遺傳進(jìn)化情況，劉懷東等對(duì)Gen?Bank 中收錄的來(lái)源于中國(guó)、美國(guó)、日本、韓國(guó)、泰國(guó)、越南和老撾共計(jì)69 條PDCoV 全基因組進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示所有PDCoV 的基因序列表現(xiàn)出較高的序列同源性但具有明顯的地域特征，聚類形成3 個(gè)大支，即美國(guó)/日本/韓國(guó)毒株為一支，越南/泰國(guó)/老撾毒株為一支以及中國(guó)毒株獨(dú)立成為一支，而其中中國(guó)毒株又表現(xiàn)出基因多樣性[50]。同樣，在Zhang 等對(duì)GenBank 中收錄的63 條PDCoV S 基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，所有序列也具有較高的同源性且系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)形成3 個(gè)大支，與上述研究結(jié)果大體一致，只是有個(gè)別中國(guó)毒株出現(xiàn)較大的差異，如四川株（CHN/Sichuan/S27/2012）、湖北株（CHN-HB-2014）和江西株（CHN/CHJXN12/2015）在S 基因存在3 個(gè)核苷酸缺失；江蘇淮安株（CH-HA1-2017 和CH-HA3-2017）在多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)氨基酸替換，聚類在越南/泰國(guó)/老撾毒株支上[49]。因此，當(dāng)前全球流行的PDCoV可能起源于同一毒株，但在流行過(guò)程中病毒基因逐漸發(fā)生變異，這些變異是否會(huì)影響病毒毒力并出現(xiàn)變異強(qiáng)毒株尚需密切追蹤病毒的進(jìn)化關(guān)系，探究其致病機(jī)制。

3 豬δ 冠狀病毒的臨床特征

PDCoV 引起的臨床癥狀與PEDV、TGEV 和PoRV等病毒感染造成的臨床癥狀極為相似，都以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水為主要特征，且主要導(dǎo)致5 日齡～21日齡仔豬腹瀉[12,14]。盡管PDCoV 引起的臨床癥狀相對(duì)較輕，但無(wú)法從臨床表現(xiàn)區(qū)分這幾種疾病。發(fā)病之初，患病仔豬表現(xiàn)出輕微腹瀉、厭食、低熱；2 d～6 d 后出現(xiàn)持續(xù)性的水樣腹瀉、嘔吐、脫水、厭食、虛弱和被毛粗亂等癥狀；部分仔豬因嚴(yán)重脫水而出現(xiàn)死亡[4,14]。臨床剖檢可見(jiàn)小腸脹氣、充滿黃色水樣內(nèi)容物、腸壁稀薄透亮、腹腔和胸腔積水以及偶伴胸腺萎縮等，對(duì)于未斷奶仔豬可見(jiàn)小腸和胃內(nèi)存在未消化的凝乳塊[51]。PDCoV 可感染各年齡段的豬，但對(duì)仔豬的發(fā)病率和死亡率最高，尤其是哺乳期的仔豬。美國(guó)豬場(chǎng)的臨床調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，部分豬場(chǎng)PDCoV 對(duì)哺乳仔豬的致死率達(dá)40%[14]；而我國(guó)的調(diào)查數(shù)據(jù)更高，Song 等發(fā)現(xiàn)個(gè)別豬場(chǎng)中PDCoV 對(duì)哺乳仔豬的致死率竟然超過(guò)80%[52]。育肥豬和母豬感染PDCoV 后多數(shù)情況下不表現(xiàn)出臨床癥狀或僅出現(xiàn)短暫腹瀉，因此在病原檢測(cè)時(shí)容易被忽視，造成帶毒母豬交叉感染仔豬的現(xiàn)象[44,52]。PDCoV 感染除了引起豬只發(fā)病，造成仔豬死亡外，對(duì)于豬群的生長(zhǎng)發(fā)育也有一定的影響。作為溶細(xì)胞性病毒，PDCoV可引發(fā)小腸細(xì)胞壞死，造成豬只腸細(xì)胞吸收功能紊亂，影響豬群的生產(chǎn)性能。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，自然感染該病的育肥豬會(huì)出現(xiàn)腹瀉癥狀，導(dǎo)致豬只厭食、生長(zhǎng)遲緩[53]；而Curry 等人工感染保育豬的研究證實(shí)，感染組的豬只在6 周內(nèi)并未與對(duì)照組的豬在生長(zhǎng)性能和組織沉積方面表現(xiàn)出差異[54]。上述PDCoV對(duì)不同年齡段豬在生長(zhǎng)性能方面的影響差異可能取決于飼養(yǎng)環(huán)境和毒株等多方面因素，其對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬的影響尚需深入研究。

PDCoV 感染豬的大小腸，空腸和回腸是病毒感染的主要腸段，支氣管上皮細(xì)胞也有病毒抗原的存在[4,6]。與PEDV 和TGEV 類似，PDCoV 感染易引起腸細(xì)胞急性壞死使得小腸的絨毛出現(xiàn)明顯萎縮，但不會(huì)造成小腸細(xì)胞的壞死[6,12]。病理組織觀察可見(jiàn)胃小凹和小腸上皮細(xì)胞壞死、腸絨毛嚴(yán)重萎縮，肺部可見(jiàn)輕微的間質(zhì)性炎癥[4-6,12]。人工感染無(wú)菌仔豬24 h 后，即可在大、小腸和糞便中檢測(cè)到高濃度的病毒RNA，而其他部位（肺臟、肝臟、腎臟、脾臟和血液）病毒核酸含量較低[6,14]。相比無(wú)菌仔豬，常規(guī)仔豬感染病毒24 h 后，僅在糞便中檢測(cè)到低量的病毒核酸，到7 dpi 時(shí)病毒排泄量達(dá)到最大且至少能體內(nèi)存在21 d[6,14,55]。針對(duì)病原分布的試驗(yàn)證實(shí)，在病毒感染的3 d～7 d，PDCoV 抗原主要集中在空腸和回腸的絨毛上皮細(xì)胞，其次是十二指腸和盲腸等組織的上皮細(xì)胞，偶見(jiàn)腸隱窩組織[6,14]。此外，在感染早期，腸道固有層、派氏結(jié)（Peyer’s patches）以及腸系淋巴結(jié)中也存在少數(shù)PDCoV 抗原陽(yáng)性細(xì)胞；在感染后23 d～35 d，感染豬出現(xiàn)康復(fù)，同時(shí)停止排毒，但大量的病毒抗原陽(yáng)性細(xì)胞仍然出現(xiàn)在上述組織[6,14]。因此，上述結(jié)果表明，盡管感染豬已經(jīng)康復(fù)，但PDCoV 可能仍存在體內(nèi)形成隱性感染。

4 小結(jié)與展望

PDCoV 作為新發(fā)的腸致病性冠狀病毒，已在全世界多個(gè)國(guó)家廣泛流行。盡管該病原較PEDV 的致死性相對(duì)較小，但其對(duì)仔豬的危害不容小視，同時(shí)其常與PEDV 及其它病毒混合感更是增加了對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害。近年來(lái)，隨著研究不斷深入，已經(jīng)對(duì)該病原的基因組結(jié)構(gòu)、蛋白功能、培養(yǎng)特性、流行特征和致病性等方面有了一定的認(rèn)識(shí)。然而仍有許多亟待解決的問(wèn)題：（1）需建立高效的分離和培養(yǎng)技術(shù)。盡管PDCoV 具有廣泛的細(xì)胞嗜性，但可用于分離培養(yǎng)的細(xì)胞系很少且條件較為苛刻，不利于疫苗的創(chuàng)制；（2）需弄清病毒的起源和傳播機(jī)制。鑒于PDCoV 能夠感染禽類、豬和牛等多種動(dòng)物，其最初的起源及其在哺乳動(dòng)物之間的跨種傳播尚需深入研究，預(yù)測(cè)其潛在的公共衛(wèi)生問(wèn)題；（3）需深入認(rèn)識(shí)蛋白功能、病原致病與免疫機(jī)理。盡管已經(jīng)獲得PDCoV 的基因組序列，但其蛋白功能的研究不足。同時(shí)缺少病原致病與免疫機(jī)理的研究，尤其病原逃避宿主免疫應(yīng)答機(jī)制，關(guān)乎疾病的防控；（4）需開(kāi)發(fā)疾病防控措施，包括PDCoV 的診斷試劑、商品化疫苗、抗病毒藥物和監(jiān)控機(jī)制。除此之外，我們對(duì)PDCoV 的生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)不足，尤其是病毒的生命周期，涉及病毒如何侵入、如何復(fù)制、如何組裝等一系列事件。因此，加強(qiáng)PDCoV 的研究，完善人們對(duì)病原的認(rèn)識(shí)，對(duì)于該病的預(yù)防和治療至關(guān)重要。