聶志文 ，張露 ，羅清 ，萬臘根

(1.上海市寶山區(qū)吳淞中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 寶山 200940；2.南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江西 南昌 330006；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus， SLE）是一種典型的自身免疫性疾病，以多種自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物沉積和多器官損傷為特征的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1，2]。 由于 SLE 臨床表現(xiàn)多樣，且大都數(shù)患者早期并無特征性表現(xiàn)，因此根據(jù)臨床表現(xiàn)對SLE 進(jìn)行診斷非常困難， 臨床上目前仍缺乏理想的SLE 診斷標(biāo)志物。 因此，迫切需要尋求一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠且無創(chuàng)的生物標(biāo)志物用于SLE 的早期診斷。 環(huán)狀RNA（Circular RNA， circRNA） 是主要由外顯子的轉(zhuǎn)錄本組成[3]，是繼 microRNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（IncRNA）之后，發(fā)現(xiàn)的一種廣泛分布在真核細(xì)胞胞質(zhì)中的新型內(nèi)源性RNA。 它具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA 核酸外切酶的影響，與線性RNA相比，CircRNA 具有顯著的非線性特征，無自由3’或 5’端非規(guī)范剪接[4]。 與線性 RNA 相比，circRNA更適合作為生物標(biāo)志物[5，6]。 最近的研究表明，circRNA 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、 動脈粥樣硬化血管疾病、朊蛋白疾病、 癌癥和自身免疫性疾病發(fā)揮一定作用[7-10]，已成為疾病診斷的新的生物標(biāo)志物，在SLE中的作用也逐漸得到大家的認(rèn)識[11]。本研究首次以外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀RNA hsa_circ_0044235 為研究目標(biāo)，探討其在SLE 中表達(dá)以及診斷和鑒別診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 病例資料 ⑴SLE 組： 收集 2016 年 11 月至2018 年8 月期間入住南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院75例SLE 患者，SLE 的診斷符合修訂后的美國風(fēng)濕病學(xué)會SLE 標(biāo)準(zhǔn)， 并除外患有基礎(chǔ)性疾病及其他免疫性疾病者。 ⑵RA 組：收集同期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院RA 患者30 例， 所有RA 患者均符合修訂的美國風(fēng)濕病學(xué)會RA 標(biāo)準(zhǔn)，并除外患有基礎(chǔ)性疾病及其他免疫性疾病者。 ⑶健康對照組：收集同期南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人58例，所有對象在最近一個月身體健康、未使用任何種類的激素及免疫抑制類藥物，無重大疾病史，不具備SLE、RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任意一條，且無自身免疫病史。 本研究經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，標(biāo)本的收取及患者信息的使用已獲得患者及家屬知情同意，所有患者及志愿者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑及實(shí)時熒光定量PCR 試劑購自日本TaKaRa 公司；Trizol 試劑及熒光定量PCR 引物購自美國賽默飛公司；Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液購自美國sigma 公司；熒光定量PCR儀北京高端偉業(yè)生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 采集研究對象空腹靜脈血5ml，EDTA-K2 抗凝， 按常規(guī)方法用 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個核細(xì)胞。

1.3.2 總RNA 提取及cDNA 合成向外周血單個核細(xì)胞細(xì)胞沉淀物中加1.0mlTrizol 試劑， 按試劑說明書提取外周血單個核細(xì)胞樣本總RNA，DEPC 水溶解。 取1μl 總RNA，按照說明書，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR 采用SYBR 法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 檢測， 檢測步驟及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進(jìn)行。 hsa_circ_0044235 基因上游引物為：5’-TGAGTTTGGTGATTCAGCTTGC-3’， 下游引物為：5’- AACAAGGCTTCTTCTGAGTGT-3’；內(nèi)參-actin 基因上游引物為：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，下游引物為：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。 反應(yīng)體系為 20μl，即：2×SYBR PreMix Ex TaqTM Ⅱ10μl、0.5μL 正向引物、0.5μL反向引物、2.0μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、ROX Reference Dye(50×) 0.2μl、ddH2O 6.8μl。 反應(yīng)條件為： 預(yù)變性95℃ 5min，95℃15s，60℃60s，72℃ 120s，40 循環(huán) ，通過溶解曲線檢測PCR 產(chǎn)物的特異性。 熒光定量PCR 檢測使用StepOnePlus 實(shí)時熒光定量PCR 儀進(jìn)行。 每孔均設(shè)3 個表達(dá)水平的散點(diǎn)圖復(fù)孔，取平均CT 值做為該樣本最后CT 值，采用β-actin 作為內(nèi)部對照，用 2-ΔCt 方法分析 hsa_circ_0044235 的相對表達(dá)。

1.4 microRNA 預(yù)測 基于 TargetScan 和 miRanda的miRNA 靶預(yù)測軟件預(yù)測circRNA/miRNA 相互作用，并對差異表達(dá)的circRNA 進(jìn)行預(yù)測，所有的比較都用CircRNA/miRNA 相互作用信息進(jìn)行了詳細(xì)的注釋。 利用上海生工設(shè)計(jì)和合成的miRNA 引物，采用實(shí)時熒光定量PCR 方法檢測SLE 患者和HC PBMC 中候選 CircRNA 的 miRNA 靶標(biāo)的表達(dá)情況。 采用U6 作為內(nèi)部對照，用2-ΔCt 方法分析miRNA 的相對表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism5.0 軟件（GraphPad Software，Inc.）和 SPSS17.0版軟件 （SPSS，Inc.） 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 以 Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)（K-S 檢驗(yàn)）對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用 Student’s t 檢驗(yàn)或非參數(shù) Mann-Whitney 檢驗(yàn)分析兩組間hsa_circ_0044235 表達(dá)的差異。 采用ANOVA 或Kruskal-Wallis 對三組之間的比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 最后，采用ROC 曲線及AUC面積評價候選hsa_circ_0044235 對SLE 的診斷價值。 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象的臨床基本特征 本研究從2016 年 11 月至 2018 年 8 月期間共招募了 75 例SLE 患者，同期招募了同時段 RA 患者 30 例，HC 58例。30 例復(fù)診SLE 患者和20 例HC 被納入初篩測試集，以檢測hsa_circ_0044235 的表達(dá)和診斷模型的構(gòu)建。 此外，45 例 SLE 患者 （13 例初診），30 例RA 和38 例HC 用于再次驗(yàn)證差異hsa_circ_0044 235 的表達(dá)及診斷價值。 見表1。

2.2 外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀RNA hsa_circ_0044 235 在SLE 患者中的表達(dá)水平 qRT-PCR 結(jié)果顯示，30 例 SLE 患者的外周血單個核細(xì)胞中hsa_circ_0044235 的表達(dá)水平明顯低于20 例HC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），見圖1。

2.3 外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀RNA hsa_circ_0044 235 對SLE 診斷的價值 采用ROC 曲線分析差異表達(dá)hsa_circ_004423 對SLE 的診斷價值，結(jié)果表明 hsa_circ_0044235 曲線下面積 （AUC） 為 0.873（95%CI：0.778-0.967，P＜0.001），敏感性=70.00%，特異性=100.00%，見圖2。

表1 研究對象臨床資料特征

圖1 外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀 RNA hsa_circ_0044235 在SLE 患者中的表達(dá)水平

圖2 SLE 患者 PBMC 中 circRNA 的 ROC 曲線分析

2.4 驗(yàn)證外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀RNAhsa_circ_00 44235 的表達(dá)及診斷價值 為了進(jìn)一步評估hsa_ci rc_0044235 在SLE 中的表達(dá)水平及診斷價值，再次檢測 45 例 SLE 患者，30 例 RA 和 38 例 HC 外周血單個核細(xì)胞中hsa_circ_0044235 表達(dá)水平。結(jié)果表明，與 RA 和 HC 相比，SLE 患者 hsa_circ_0044235 的水平均明顯降低（P＜0.0001）（圖3A）。 進(jìn)一步的ROC 曲線分析表明，SLE 患者和HC hsa_circ_0044235 的 AUC 值為 0.861（95%CI，0.783-0.939;P＜0.001;敏感性= 86.67%;特異性=71.05%)(圖3B)。隨后為了分析hsa_circ_0044235 對SLE 鑒別診斷的價值，本文就SLE 患者與所有對照組（HC 和RA患者），疾病對照組（RA 患者）進(jìn)行了ROC 曲線分析。 就 SLE 患者與所有對照組（HC 和 RA 患者）而言，hsa_circ_0044235 的 AUC 為 0.845（95%CI：0.77 4-0.916;P＜0.0001;敏感性=66.4 4%;特異性=89.71%）（圖3C），就 SLE 患者和疾病對照組（RA 患者）而言，hsa_circ_0044235 的 AUC 為 0.825 （95%CI，0.734-0.916；P＜0.0001；敏感性=64.44%；特異性=86.67%）見圖3D。

圖3 差異表達(dá)的PBMC circRNA 的診斷價值的雙重驗(yàn)證

2.5 與 hsa_circ_0044235 相互作用的 miRNA 為了確定hsa_circ_0044235 的潛在功能，我們通過使用miRanda 軟件與MRE 進(jìn)行比對，預(yù)測了hsa_circ_0044235 的潛在miRNA 靶標(biāo)。確定了3 個假定的miRNA （hsa-miR-892a，hsa-miR-135b-5，hsamiR-135a-5p）。采用 qRT-PCR 檢測 SLE 和 HC 外周血單個核細(xì)胞中這三個miRNA 表達(dá)情況。 結(jié)果表明，hsa_circ_0044235 的潛在 miRNA 靶標(biāo) hsamiR-135a-5p 和 hsa-miR-135b-5p 表達(dá)水平在SLE 患者和HC 外周血單個核細(xì)胞中沒有明顯差異（圖4A 和B)，而SLE 患者外周血單個核細(xì)胞中hsa_circ_0044235 的潛在 miRNA 靶標(biāo) hsa-miR-892a 表達(dá)水平明顯高于HC，見圖4C。

3 討論

圖4 與hsa_circ_0044235 相互作用的miRNA 的表達(dá)水平

circRNA 是一類特殊的內(nèi)源性RNA，可用來作為疾病診斷的新的生物標(biāo)志物[12]。 李等人[13]描述了SLE 患者血漿中circRNA 的綜合表達(dá)譜，并開啟了circRNA 作為SLE 疾病新的無創(chuàng)生物標(biāo)志物的研究。 來自Zhang 等人[14]的證據(jù)表明，外周血單個核細(xì)胞中的circRNA 可能作為SLE 的潛在生物標(biāo)志物。 此外，我們之前的研究也表明外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀RNA hsa_circ_0000479 在SLE 患者中特異性的高表達(dá)，且hsa_circ_0000479 表達(dá)水平與SLE患者的疾病活動性和治療相關(guān)， 進(jìn)一步ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn) hsa_circ_0000479 的 AUC 大于 0.75，因此hsa_circ_0000479 可作為SLE 的一種潛在的新型分子標(biāo)志物。

環(huán)狀 RNA hsa_circ_0044235 位于 17 號染色體，即 17 號染色體 45247282-45259003（負(fù)鏈），被RNA 轉(zhuǎn)錄酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄本有 350nt。 本課題組之前研究采用芯片檢測SLE 患者外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀RNA 表達(dá)譜顯示環(huán)狀RNA hsa_circ_004 4235 明顯下調(diào)。 目前尚未見有關(guān)環(huán)狀 RNA hsa_circ_0044235 的研究報(bào)道。 為了探討 PBMC 中下調(diào)的hsa_circ_0044235 是否可作為SLE 的診斷生物標(biāo)志物，本研究通過初步驗(yàn)證和雙重驗(yàn)證來證實(shí)。 初步驗(yàn)證結(jié)果表明，hsa_circ_0044235 的AUC值為0.873。 雙重驗(yàn)證結(jié)果顯示，這些circRNA 在區(qū)分SLE 患者和HC 時產(chǎn)生的AUC 值與初步驗(yàn)證結(jié)果相似， 表明外周血單個核細(xì)胞中下調(diào)的hsa_circ_0044235 對 SLE 有潛在的診斷價值。 此外，本文對hsa_circ_0044235 在區(qū)分SLE 和其他自身免疫性疾?。≧A）方面的效果進(jìn)行了評估，研究結(jié)果顯示 hsa_circ_0044235 可有效區(qū)分 SLE 患者和RA 患者。

越來越多的證據(jù)表明，circRNA 可能通過與目標(biāo)miRNAs 結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)功能。 李等人[15]研究表明hsa_circ_0045272 可通過直接結(jié)合miR-6127在SLE 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。 本研究通過初步驗(yàn)證和雙重驗(yàn)證證實(shí)SLE 患者外周血單個核細(xì)胞中的hsa_circ_0044235 明顯下調(diào)。為了探討下調(diào)的hsa_circ_0044235 在SLE 中的潛在作用，本研究采用生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)circRNA 的潛在的mi RNAs 靶標(biāo)進(jìn)行了預(yù)測，分別獲得了 hsa_circ _0044235 的 3 種可能mi RNAs 靶標(biāo)。 我們檢測和比較了SLE 患者和HC PBMC 中這些預(yù)測的mi RNAs 靶標(biāo)的表達(dá)水平。 結(jié)果顯示，SLE 患者外周血單個核細(xì)胞中hsa -miR -892a 水 平 明 顯 升 高 ， 提 示hsa_circ_0044235 可能通過與 hsa-miR-892-a 相互作用而在 SLE 中發(fā)揮作用。 然而，hsa_circ_0044235 在SLE 中的確切機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，SLE 患者外周血單個核細(xì)胞環(huán)狀RNA hsa_circ_0044235 的表達(dá)明顯下調(diào)，可能作為SLE 的潛在診斷及鑒別診斷標(biāo)志物。 且環(huán)狀RNA hsa_circ_0044235 可能通過與 hsa-miR-892-a 相互作用而在SLE 中發(fā)揮作用。