樊志剛， 高 麗， 師瑞紅

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理學(xué)教研室，鄭州 451191)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病因尚未明確，可能與包括遺傳在內(nèi)的多種因素有關(guān)[1]，其病理特征為黑質(zhì)致密部的色素脫失和多巴胺(DA)神經(jīng)元的大量喪失及路易小體的出現(xiàn)，好發(fā)于中老年人，平均始發(fā)年齡為57歲，大于60歲的患病率1%～2%[2]。目前PD治療仍以左旋多巴為代表的藥物治療為主，藥物治療只能暫時(shí)緩解臨床癥狀，不能從根本上替代黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的變性缺失。

目前，細(xì)胞治療成為了一個(gè)新的方向，PD的細(xì)胞治療主要是將各種DA能細(xì)胞移植入紋狀體[3-5]。多年來人們嘗試各種細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行研究,臍血又稱胎盤血或臍帶血，是胎兒出生時(shí)臍帶內(nèi)和胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液。臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞[6](mesenchymal stem cells，MSCs)，但干細(xì)胞分化為DA能神經(jīng)元比率較低，體內(nèi)存活能力較差，與其所處局部微環(huán)境密切相關(guān)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞與宿主損傷組織間的相互作用可導(dǎo)致一些炎癥因子的表達(dá)變化，這些炎癥介質(zhì)在功能恢復(fù)方面起著重要作用。本次實(shí)驗(yàn)將在體外培養(yǎng)的人臍血來源間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell，HUMSCs)立體定向注射到PD大鼠腦室內(nèi)，觀察移植后對(duì)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為和炎癥因子的影響，旨在為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和臨床移植途徑提供更多選擇，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，雄性SD大鼠20只，清潔級(jí)，體質(zhì)量220～250 g用于PD造模，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：2019-0003?；\中喂養(yǎng)，飼養(yǎng)過程中給予充足的飲水和飼料，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 主要試劑和儀器 6-羥基多巴胺(H4381-100 mg)、阿撲嗎啡(H4393-100 mg)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))；臍血干細(xì)胞提純分離試劑(天津生物制藥公司)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(ELISA)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;白細(xì)胞介素-4(IL-4)試劑盒檢測(cè)范圍20～400 ng·L-1，腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒檢測(cè)范圍80～1 000 ng·L-1；寶特Epoch酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡Olympus BX41購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠模型的建立 用35 g·L-1水合氯醛(350 mg·kg-1)(青島宇龍海藻，國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673，規(guī)格：0.5 g)腹腔注射麻醉SD大鼠后，將大鼠固定于立體定向器上，以前囟為零點(diǎn)，參照文獻(xiàn)[8]的《大鼠腦立體定位圖譜》，確定大鼠右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束(anterior medial cerebral bundle，MFB)和腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)兩點(diǎn)坐標(biāo)(MFB為前囟后4.1 mm，矢狀縫右側(cè)1.7 mm，顱骨下7.8 mm；VTA為前囟后4.5 mm，矢狀縫右側(cè)1.5 mm，顱骨下7.8 mm)。向每點(diǎn)用微量進(jìn)樣器注射新鮮配置的6-羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine，6-OHDA)溶液5 μL。1周后腹腔注射阿撲嗎啡(1.0 mg·kg-1)以誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，編制隨機(jī)數(shù)目表，用完全隨機(jī)法將20只造模成功大鼠分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，各10只。

1.2.2 臍血干細(xì)胞制備 ①選擇35歲以下健康產(chǎn)婦的產(chǎn)后臍帶內(nèi)殘余血液，采集臍帶血之前產(chǎn)婦知情同意并簽署捐獻(xiàn)同意書。每份有效臍帶血量為80～160 mL。②采集好的臍帶血在30 min內(nèi)利用臍血干細(xì)胞提純分離試劑進(jìn)行提純分離干細(xì)胞，將分離的細(xì)胞以5×106mL-1接種于含體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清(普諾賽，批號(hào)164210，規(guī)格：100 mL)的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)觀察。取第4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 臍血干細(xì)胞移植 取第4代HUMSCs將調(diào)整細(xì)胞濃度調(diào)整為3.0×105μL-1，立即進(jìn)行細(xì)胞移植。將PD模型大鼠麻醉后固定于立體定位器上，以前囟為零點(diǎn)，定位右側(cè)紋狀體2個(gè)移植點(diǎn)：前囟前1.1 mm，矢狀縫右2.7 mm，顱骨下5.1 mm；前囟前1.3 mm，矢狀縫右2.7 mm，顱骨下7.1 mm。實(shí)驗(yàn)組每點(diǎn)注射5 μL HUMSCs，對(duì)照組按上述方法和坐標(biāo)，注入5 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 行為學(xué)檢測(cè) 移植后每周1次腹腔注射阿撲嗎啡(1.0 mg·kg-1)，觀察PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改善。細(xì)胞移植后3、6、9周，每組每只大鼠腹腔注射1.0 mg·kg-1的阿撲嗎啡，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)測(cè)試，注射后15 min開始計(jì)數(shù)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，并計(jì)數(shù)1 min。

1.2.4.2 ELISA法檢測(cè) 腦內(nèi)炎癥因子水平細(xì)胞移植后3、6、9周，每組各取大鼠3只，以戊巴比妥鈉麻醉后取腦，參照文獻(xiàn)[9]實(shí)驗(yàn)方法使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行組織蛋白定量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)TNF-α及IL-4水平。

2 結(jié)果

2.1 HUMSCs分離培養(yǎng) 倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)初期胞體小且呈圓形，7 d以后逐漸變?yōu)闄E圓，胞體變大。見圖1。14 d(第4代)后向兩級(jí)伸出凸起為長(zhǎng)梭形。見圖2。

圖2 14 d臍血干細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.2 HUMSCs移植對(duì)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響 與對(duì)照組比較，移植后3周實(shí)驗(yàn)組PD大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，移植后6、9周，實(shí)驗(yàn)組旋轉(zhuǎn)次數(shù)均出現(xiàn)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與移植前比較，實(shí)驗(yàn)組移植后6、9周，旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 HUMSCs移植對(duì)PD大鼠腦內(nèi)TNF-α水平的影響 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植后3周，TNF-α水平下降不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植后6、9周，TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與移植前比較，實(shí)驗(yàn)組移植后6、9周，TNF-α水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4 HUMSCs移植對(duì)PD大鼠腦內(nèi)IL-4的影響 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植后3周，IL-4水平升高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組移植后6、9周，IL-4水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與移植前比較，實(shí)驗(yàn)組移植后6、9周，IL-4水平也顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 移植HUMSCs前后2組PD大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)比較

表2 移植HUMSCs前后2組TNF-α水平比較

表3 移植HUMSCs前后2組IL-4水平比較

3 討論

目前用于治療PD的細(xì)胞主要有MSCs、胚胎干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞[10]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖及分化能力，不易成瘤，免疫原性低，是干細(xì)胞治療理想的首選細(xì)胞之一[11]。HUMSCs可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞，并分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)等多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[12]。實(shí)驗(yàn)[13-14]證實(shí)，猴子紋狀體內(nèi)移植HUMSCs可在其腦內(nèi)存活并向黒質(zhì)遷移，且動(dòng)物肢體力量、平衡能力增強(qiáng)，機(jī)械運(yùn)動(dòng)也無障礙。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在移植后6、9周大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)較移植前均顯著下降;且均低于對(duì)照組的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，表明HUMSCs移植有利于PD大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善。

研究[15]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子構(gòu)成的炎癥免疫微環(huán)境與MSCs移植效果密切相關(guān)，細(xì)胞移植后與宿主間發(fā)生相互作用，上調(diào)或下調(diào)特定細(xì)胞因子水平，進(jìn)一步影響細(xì)胞的存活、遷移及分化。TNF-α為常見促炎癥因子，可激活多條信號(hào)通路，如核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、Smad泛素調(diào)節(jié)因子1(Smurf 1)等信號(hào)通路，并抑制Runx2的表達(dá)，NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與細(xì)胞增殖、凋亡等生理過程，還參與炎癥、免疫反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄過程[16-17]。NF-κB信號(hào)通路分為經(jīng)典通路與非經(jīng)典通路，經(jīng)典通路由TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子活化，非經(jīng)典通路則主要是由BAFF、CD40L、LT-βR等TNF-α受體家族亞類活化。白細(xì)胞介素是一種多細(xì)胞源的細(xì)胞因子，在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)，可通過刺激巨噬細(xì)胞極化及成纖維細(xì)胞活化來促進(jìn)神經(jīng)纖維再生[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植后6、9周，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦內(nèi)TNF-α較對(duì)照組明顯減低,說明HUMSCs移植后可顯著抑制TNF-α的水平，減少炎癥反應(yīng)對(duì)功能恢復(fù)的不利影響。相對(duì)于對(duì)照組，HUMSCs移植后6、9周，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦內(nèi)IL-4水平均明顯升高，說明HUMSCs移植后,抗炎因子IL-4的升高抑制了促炎因子的表達(dá)，可能間接促使了大鼠旋轉(zhuǎn)行為有了明顯改善。

目前MSCs移植治療PD的機(jī)制還不十分清楚，有研究[5]表明是促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的分化；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡；促進(jìn)血管再生，重建突觸等。本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足，PD主要是DA能神經(jīng)元受損，在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)DA的含量，用免疫組化證實(shí)DA能神經(jīng)元的恢復(fù)等。

綜上所述，HUMSCs移植后一定時(shí)間可以明顯改善PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為，降低TNF-α水平和提高抗炎因子IL-4的水平。