朱建光，沈露，周漢義，鄭曦，劉啟勝

咸寧市中心醫(yī)院(湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院)，湖北咸寧437100

慢性丙型肝炎(CHC)是一種因感染丙型肝炎病毒而導(dǎo)致的慢性肝臟疾病，臨床主要表現(xiàn)為食欲不振、黃疸癥狀。CHC患者中約50%處于慢性持續(xù)感染狀態(tài)，后期可并發(fā)肝硬化、肝性腦病、肝癌等，對(duì)患者的健康造成嚴(yán)重影響[1]。因此，定期復(fù)查，全面了解和評(píng)估肝功能和肝纖維化程度對(duì)延緩疾病進(jìn)展至關(guān)重要，目前臨床主要應(yīng)用肝穿刺活檢評(píng)估肝纖維化程度，但由于肝穿刺活檢為有創(chuàng)操作，易并發(fā)出血，臨床應(yīng)用受限[2]。所以，尋找一種無創(chuàng)而高效的方法評(píng)價(jià)肝纖維化程度成為亟待解決的難題。細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)是表達(dá)于T細(xì)胞的自分泌因子，可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌免疫相關(guān)因子，參與CHC進(jìn)程。Toll樣受體2(TLR2)是丙型肝炎病毒的主要致病通路。目前關(guān)于TLR2及CTLA-4與肝纖維化的關(guān)系鮮見報(bào)道[3，4]。2017年1月—2019年12月，我們檢測(cè)了CHC患者外周血單核細(xì)胞中TLR2及CTLA-4 mRNA的表達(dá)，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1月—2019年12月于我院就診的CHC患者100例(CHC組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合CHC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②住院時(shí)間大于1周；③患者或其家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腎、心血管、泌尿等其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；②同時(shí)合并甲肝、乙肝病毒感染者；③近期有感染或血液系統(tǒng)疾病者。男68例、女32例，年齡(63.58±2.58)歲，BMI(23.19±1.28)kg/m2。隨機(jī)選擇同期體檢健康者100例作為對(duì)照組，男70例、女30例，年齡(64.14±1.46)歲，BMI(23.56±1.65)kg/m2。兩組性別、年齡、BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 肝纖維化的診斷和分期 于B超引導(dǎo)下選擇右腋前線第7、8、9肋間作為穿刺區(qū)域，穿刺時(shí)注意避開心臟和大血管，取組織活檢，并分別由2名以上病理科專業(yè)人員對(duì)組織圖片進(jìn)行判讀，根據(jù)肝纖維化程度分為5期，F(xiàn)4期：早期肝硬化；F3期：大量纖維間隔形成，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂但無肝硬化；F2期：纖維化擴(kuò)大至匯管區(qū)周圍并形成纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)仍保留；F1期：竇周及小葉內(nèi)纖維化，局限性匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大；F0期：無明顯纖維化[6]。本研究F0期15例，F(xiàn)1期19例，F(xiàn)2期39例，F(xiàn)3期21例，F(xiàn)4期6例。

1.3 實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) CHC組于入院當(dāng)天(對(duì)照組于體檢日)抽取空腹外周靜脈血10 mL，3 000 r/min離心6 min(離心半徑10 cm)，靜置取上清，用全自動(dòng)生化分析儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，BK-200)和血液分析儀(廣州市樂邦醫(yī)療器械有限公司，SK5002)檢測(cè)血清血小板(PLT)、甲胎蛋白(AFP)、AST、ALT、谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)、TC和總膽紅素(TBil)，并根據(jù)PLT、ALT、GGT、CHOL、AST值計(jì)算基于4因子的纖維化指數(shù)(FIB-4指數(shù))、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶-血小板比值指數(shù)(APRI)、Forns 指數(shù)[7]。FIB-4 指數(shù)=年齡(歲)×AST(U/L)/血小板計(jì)數(shù)(×109/L)×ALT1/2(U/L)；APRI=AST(U/L)÷PLT(×109/L)；Forns指數(shù)=7.811-3.131×ln(PLT[×109/L])+0.781×ln(GGT[IU/L])+3.467×ln年齡-0.014×CHOL[mmol/L]。

1.4 CHC患者外周血單核細(xì)胞中TLR2 mRNA及CTLA-4 mRNA表達(dá)檢測(cè) 用Ficoll密度離心法分離外周血單核細(xì)胞，提取細(xì)胞中的RNA，并用紫外分光光度計(jì)(深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司，UV3200S)測(cè)量RNA的量，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，用RT-PCR(儀器及試劑盒由深圳市康初源有限公司提供，貨號(hào)：210212)檢測(cè)TLR2 mRNA(正向引物序列：5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′，反向引物序列:5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′)及CTLA-4 mRNA(正向引物序列：5′-GACCAGGGACTCTACATCTGC-3′，反向引物序列：5′-TCACATTCTGGCTCTGTTGG-3′)的表達(dá)量。RT-PCR擴(kuò)增循環(huán)設(shè)置參數(shù)：預(yù)變性(94 ℃, 1 min)后，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)擴(kuò)展梯度(94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min)，末次延伸(72 ℃,10 min)。以空白對(duì)照進(jìn)行基線調(diào)整，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△CT方法計(jì)算目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 CHC組AST、AFP、ALT、GGT、TBil、CTLA-4 mRNA、FIB-4 指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)高于對(duì)照組，PLT、TLR2 mRNA低于對(duì)照組(P均<0.05)，見表1。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)果

2.2 不同肝纖維化程度者血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表達(dá)比較 隨著肝纖維化程度增加，CTLA-4 mRNA表達(dá)升高、TLR2 mRNA表達(dá)降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

表2 CHC組不同纖維化分級(jí)患者血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表達(dá)比較

2.3 CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA與肝纖維化的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AST、AFP、ALT、FIB-4 指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)與CTLA-4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.427、0.547、0.351、0.572、0.472、0.569，P均<0.05)，與TLR2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.471、-0.427、-0.317、-0.488、-0.533、-0.468，P均<0.05)；PLT與CTLA-4 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.427，P<0.05)，與TLR2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.571，P<0.05)，總膽紅素與CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA表達(dá)無關(guān)(r分別為0.132、0.174，P均>0.05)。

2.4 發(fā)生明顯肝纖維化(F2～F4)與無或輕度肝纖維化(F0+F1)患者臨床指標(biāo)比較 無或輕度肝纖維化的AST、PLT、AFP、ALT、FIB-4 指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)、GGT、CTLA-4 mRNA小于明顯肝纖維化，TLR2 mRNA大于明顯肝纖維化(P均<0.05)，兩者總膽紅素比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 明顯肝纖維化與無或輕度肝纖維化患者臨床指標(biāo)結(jié)果

2.5 血清CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA水平預(yù)測(cè)明顯肝纖維化的診斷效能 CTLA-4 mRNA診斷明顯肝纖維化的臨界值為1.35，靈敏度為0.836，特異度為0.894，ROC曲線下面積為0.889(95%CI:0.834～0.944)，TLR2 mRNA診斷明顯肝纖維化的臨界值為1.10，靈敏度為0.816，特異度為0.885，ROC曲線下面積為0.868(95%CI:0.803～0.933)。見圖1、圖2。

圖1 CTLA-4 mRNA診斷明顯肝纖維化的ROC曲線

圖2 TLR2 mRNA診斷明顯肝纖維化的ROC曲線

3 討論

CHC是一種慢性肝臟炎性疾病，由急性丙型肝炎病毒感染轉(zhuǎn)化而來，易進(jìn)展為肝硬化、肝癌，其中肝纖維化在CHC疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[8]。肝纖維化是肝臟疾病進(jìn)展為肝硬化的階段之一，早期肝纖維化為一種可逆過程。因此，早期對(duì)肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)判對(duì)控制甚至逆轉(zhuǎn)患者病情有重要作用。肝穿刺活檢為判斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于存在風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用高昂等原因難以在臨床上推廣，而目前臨床上使用的無創(chuàng)性檢查包括影像學(xué)檢查和APRI等的準(zhǔn)確性有待提高[9]?；蚺c肝纖維化的相關(guān)研究成為研究熱點(diǎn)。研究表明，相關(guān)基因可通過表達(dá)一系列細(xì)胞因子，參與CHC疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。

研究表明，丙型肝炎所致肝硬化是由于丙型肝炎病毒感染后，機(jī)體免疫紊亂而導(dǎo)致的疾病，丙型肝炎病毒可通過刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，破壞CD3、CD4細(xì)胞，使相關(guān)細(xì)胞不能發(fā)揮免疫殺傷和免疫調(diào)節(jié)作用，從而不能有效發(fā)揮清除病毒，使病情遷延不愈[11，12]。CTLA-4、TLR2被認(rèn)為是免疫相關(guān)細(xì)胞表面蛋白，主要由調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞合成。CTLA-4是免疫球蛋白超基因家族成員，與B7具有較高的親和力(CD28的10倍)，對(duì)T細(xì)胞增殖及免疫反應(yīng)均有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。正常情況下，外來免疫原激活機(jī)體免疫時(shí)促使CD28與B7結(jié)合，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖活化，發(fā)揮免疫作用清除異物。而CHC患者體內(nèi)CTLA-4表達(dá)顯著升高，CTLA-4競(jìng)爭(zhēng)性與CD229同B7結(jié)合，形成免疫抑制復(fù)合物，阻礙CD28信號(hào)通路傳導(dǎo)，下調(diào)T細(xì)胞的活性，減緩T細(xì)胞的活化與增殖，從而使機(jī)體對(duì)丙肝抗原的清除作用減弱，使病情加重[3]。TLR2是一種重要的膜蛋白識(shí)別受體，具有抗原識(shí)別作用，當(dāng)丙型肝炎病毒侵入機(jī)體時(shí)被激活，使NF-κB等通路活化，進(jìn)一步激活下游的炎性因子和細(xì)胞因子，參與對(duì)病毒的清除作用[11]。本研究結(jié)果顯示，CHC患者體內(nèi)CTLA-4 mRNA表達(dá)升高，而TLR2 mRNA表達(dá)降低。進(jìn)一步對(duì)肝纖維化亞組分析，隨著肝纖維化程度的加重，CTLA-4 mRNA逐漸增加，TLR2 mRNA逐漸減小。表明CHC患者肝纖維化受累程度越重，體內(nèi)CTLA-4蛋白表達(dá)增加而TLR2蛋白減少，免疫抑制程度加深。胡安印等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4是多種免疫性疾病的介導(dǎo)因子，在類風(fēng)濕、自身免疫性肝病等多種疾病中發(fā)揮作用。楊景毅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2可通過MAPK/ERK通路抑制乙肝病毒的復(fù)制，促進(jìn)機(jī)體對(duì)病毒的清除作用，延緩慢性乙肝以及肝硬化的進(jìn)程，臨床不僅可通過檢測(cè)TLR2水平評(píng)估肝硬化的程度，也為肝癌的治療提供了突破口。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CHC組AST、AFP、ALT、GGT、總膽紅素、CTLA-4 mRNA、FIB-4 指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)高于對(duì)照組，PLT、TLR2 mRNA低于對(duì)照組。CHC患者肝細(xì)胞嚴(yán)重破壞，對(duì)膽紅素的處理能力降低，肝細(xì)胞內(nèi)的酶如AST、ALT、GGT釋放入血，可通過檢測(cè)血液中肝細(xì)胞內(nèi)酶的含量來評(píng)價(jià)肝功能，同時(shí)肝臟是造血器官，慢性肝炎時(shí)PLT的含量明顯降低。FIB-4指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)是通過計(jì)算患者年齡、AST、ALT、GGT等得到的，是目前臨床上較常使用的肝纖維化評(píng)價(jià)指標(biāo)。沈偉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，APRI對(duì)肝纖維化的特異度較高，肝纖維化與FIB-4指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)等呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CTLA-4 mRNA表達(dá)與FIB-4 指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)呈正相關(guān)，TLR2 mRNA表達(dá)與FIB-4 指數(shù)、APRI、Forns 指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)可通過檢測(cè)CTLA-4、TLR2 mRNA 表達(dá)來判斷肝纖維化程度。通過分析發(fā)現(xiàn)，CTLA-4、TLR2 mRNA診斷明顯肝纖維化的敏感度和特異度均大于0.7，ROC曲線下面積分別為0.889、0.868。提示應(yīng)用CTLA-4 mRNA、TLR2 mRNA預(yù)測(cè)肝纖維化有一定臨床價(jià)值。

綜上所述，外周血單核細(xì)胞中CTLA-4、TLR2 mRNA表達(dá)與CHC患者肝纖維化程度有關(guān)。臨床可通過檢測(cè)CTLA-4、TLR2 mRNA來預(yù)測(cè)肝纖維化情況，并指導(dǎo)臨床治療。