張晶，畢利泉，辛萱，王翠翠，劉曉紅

1 山東省立第三醫(yī)院，濟(jì)南250031；2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六〇醫(yī)院

乙型肝炎病毒(HBV)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV基因組具有四個(gè)開放讀碼框，其中X基因是最小的一個(gè)，其編碼的HBx蛋白在轉(zhuǎn)錄水平反式激活病毒基因表達(dá)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌組織中存在頻發(fā)的HBx基因的缺失突變，導(dǎo)致HBx蛋白羧基端氨基酸的缺失，但其確切生物學(xué)功能和作用機(jī)制尚不清楚[2,3]。既往我們?cè)谌烁伟┙M織中發(fā)現(xiàn)了HBx基因的自然缺失突變體，其編碼的HBx蛋白羧基端129-154aa缺失，我們命名為HBx-128w[4]。2012年3月—2015年12月，我們構(gòu)建了含全長(zhǎng)序列野生型HBx(HBx-FJ)和羧基端缺失129-154aa突變型HBx(HBx-128w)的真核表達(dá)載體，用pcDNA3.1空載體作為對(duì)照，通過(guò)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721并檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生物學(xué)活性，了解該自然缺失突變體和野生型HBx蛋白對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從而明確這兩種蛋白在肝癌發(fā)生中的作用及功能差異。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721(以下稱SMMC-7721細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。重組表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx-128w和pcDNA3.1-HBx-FJ購(gòu)自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；鼠抗HBxAg單克隆抗體、辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗兔IgG二抗、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；G418培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、溴化乙啶、RNaseA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell小室及Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司；多聚甲醛、結(jié)晶紫均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)產(chǎn)品；SPF級(jí)5周齡雄性BALB/C裸小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。NanoDrop ND-1000超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Nanodrop公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；Synergy酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；流式細(xì)胞儀FACScan購(gòu)自美國(guó)Becton Dicknson公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選 SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱，隔天換液1次，PBS洗滌2次，3～4 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SMMC-7721細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化2 min，用含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。以每孔6×105個(gè)接種于6孔板，隨機(jī)分為pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將6孔板放入5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞80%～90%融合時(shí)取出，去除原培養(yǎng)基，加入500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，備用。取10 μL LipofectamineTM2000試劑加入到240 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫孵育5 min；4 μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒加入到240 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫孵育5 min。將這兩種稀釋物混合形成質(zhì)粒-LipofectamineTM2000混合物，室溫孵育20 min。將質(zhì)粒-LipofectamineTM2000混合物平均分配至待轉(zhuǎn)染孔中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。去除含質(zhì)粒-LipofectamineTM2000復(fù)合物的培養(yǎng)基，添加含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取1/3的細(xì)胞用PBS沖洗，胰蛋白酶消化后加入6孔板，并加入含G418(終濃度為600 μg/mL)的培養(yǎng)基，每3 d更換1次新的G418篩選培養(yǎng)基，10 d左右可見大部分細(xì)胞死亡，降低G418濃度至300 μg/mL繼續(xù)培養(yǎng)，每周更換1次新的篩選培養(yǎng)基，至培養(yǎng)皿中可見少量肉眼可見的克隆，將之用胰蛋白酶消化后擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞HBx蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取培養(yǎng)48 h的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，PBS清洗2次，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，冰上將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至EP管中，100 ℃水浴10 min，12 000 g離心5 min(離心半徑10 cm)，取上清，上樣至10%的SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)電泳(100 V)。濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜3次，加入鼠抗HBxAg單克隆抗體4 ℃過(guò)夜，β-actin作為內(nèi)參。次日加入HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影成像。

1.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，形成密度為5×104/mL的單細(xì)胞懸液。按1×104/孔接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。接種后每24 h為1個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，連續(xù)檢測(cè)7 d。檢測(cè)時(shí)每孔中避光加入5 mg/mL MTT液繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后除去培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，避光反應(yīng)15 min。每孔各取100 μL轉(zhuǎn)移至新的酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀上讀取570 nm波長(zhǎng)處的OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD570值為縱坐標(biāo)并繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，按3×102/孔細(xì)胞密度接種于6孔板，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，至出現(xiàn)肉眼可見的克隆，4%多聚甲醛固定15 min，0.4%結(jié)晶紫染液染色10 min，PBS沖洗、拍照并計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞周期測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，制成密度為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，按2×106/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后終止培養(yǎng)，除去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS清洗2次，1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，棄上清，加入70%乙醇4 ℃過(guò)夜固定。加入PBS離心，用200 μL的PBS重懸細(xì)胞，100 μg/mL RNaseA 37 ℃消化30 min。加入50 μg/mL溴化乙啶4 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液。按1×105/孔接種于6孔板中，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待融合度達(dá)到90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用200 μL Tip頭部垂直快速劃痕，PBS洗去劃下的細(xì)胞，記錄時(shí)間為0 h，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件測(cè)量劃痕區(qū)寬度，計(jì)算劃痕寬度百分比(%)=(48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.8 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶8稀釋 Matrigel膠，平鋪于Transwell上室。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按1×104個(gè)(200 μL)加入到上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄掉下室的培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定15 min，0.4%結(jié)晶紫染液染色10 min，除去上室殘留的細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)不同的視野(×100)拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.9 各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞體外成瘤能力檢測(cè) 采用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。裸小鼠置于層流架中SPF條件下飼養(yǎng)，所用飼料、墊料、籠具及器械均高壓消毒后使用。將9只SPF級(jí)5周齡雄性BALB/C裸小鼠隨機(jī)分為3組，分別接種pcDNA3.1-HBx-FJ、pcDNA3.1-HBx-128w、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細(xì)胞。每只小鼠于頸背部皮下接種，接種后10 d左右腫瘤生長(zhǎng)至可測(cè)量大小，之后每4～5 d測(cè)量腫瘤體積，接種后第32天無(wú)痛處死裸鼠，測(cè)量各移植瘤的重量。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞HBx蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示，HBx-FJ組和HBx-128w組SMMC-7721細(xì)胞檢測(cè)到HBx陽(yáng)性條帶，而pcDNA3.1組無(wú)此條帶，提示HBx蛋白在HBx-FJ組和HBx-128w組SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。

2.2 各組SMMC-7721細(xì)胞增殖活性比較 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從第2天開始，HBx-FJ組和HBx-128w組細(xì)胞增殖能力高于pcDNA3.1組(P<0.05)；從第4天開始，HBx-128w組細(xì)胞增殖能力高于HBx-FJ組(P<0.05)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后各組SMMC-7721細(xì)胞增殖活性比較

2.3 各組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較 pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組細(xì)胞的克隆形成率分別為40.11%±5.32%、52.67%±6.34%、70.78%±4.53%，HBx-FJ組和HBx-128w組細(xì)胞增殖能力高于pcDNA3.1組，而HBx-128w組細(xì)胞增殖能力高于HBx-FJ組(P均<0.05)。

2.4 各組SMMC-7721細(xì)胞周期比較 流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，HBx-FJ組和HBx-128w組G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多(P<0.05)；而HBx-FJ組和HBx-128w組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后各組SMMC-7721細(xì)胞周期分布

2.5 各組SMMC-7721細(xì)胞遷移能力比較 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組細(xì)胞的劃痕寬度百分比分別為84.44%±6.74%、72.78%±4.19%、46.67%±12.02%。與pcDNA3.1組和HBx-FJ組相比，HBx-128w組細(xì)胞的遷移距離增加(P<0.05)；而pcDNA3.1組和HBx-FJ組細(xì)胞遷移能力比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.6 各組SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力比較 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(35.2±6.14)、(63.2±7.50)、(93.0±7.18)個(gè)。與pcDNA3.1組相比，HBx-FJ組和HBx-128w組的穿膜細(xì)胞數(shù)增加(P均<0.05)；與HBx-FJ組相比，HBx-128w組穿膜細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。

2.7 各組SMMC-7721細(xì)胞體外成瘤能力比較 移植瘤體積測(cè)量結(jié)果顯示，HBx-128w組移植瘤體積大于HBx-FJ組和pcDNA3.1組(P均<0.05)；而HBx-FJ組移植瘤體積雖大于pcDNA3.1組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。移植瘤重量測(cè)量結(jié)果顯示，pcDNA3.1組、HBx-FJ組、HBx-128w組移植瘤重量分別為(90.435±49.526)、(190.092±51.631)、(255.995±31.658)mg；與pcDNA3.1組相比，HBx-FJ組和HBx-128w組移植瘤重量增加(P均<0.05)；而HBx-128w組移植瘤重量雖大于HBx-FJ組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 轉(zhuǎn)染后各組移植瘤體積比較

3 討論

2018年2月，中國(guó)國(guó)家癌癥中心發(fā)布最新癌癥數(shù)據(jù)，肝癌是中國(guó)第四位的常見惡性腫瘤和第二位的腫瘤致死原因，全世界新發(fā)肝癌病例約50%來(lái)自我國(guó)，而我國(guó)的肝癌患者多與HBV慢性感染有關(guān)，往往具有肝纖維化、肝硬化背景[5,6]。目前， HBV基因組的整合與突變被認(rèn)為可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展[7～9]。HBV基因組是一種部分雙鏈的環(huán)狀DNA分子，雙鏈長(zhǎng)度不等，其長(zhǎng)鏈含有4個(gè)公認(rèn)的開放讀碼框——S、C、P、X[10]，其中X基因是較易被整合的基因，頻繁整合于宿主基因組，導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定和突變的發(fā)生，是HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素[11]，其編碼基因區(qū)位于1374～1838核苷酸，整合后的X基因編碼HBx蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約17 kD，有145～154個(gè)氨基酸殘基，是具有廣泛激活作用的反式作用因子[12]。其反式激活功能與抗細(xì)胞增殖、促細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，此有利于HBV在宿主體內(nèi)的感染與復(fù)制。由于HBx蛋白不能直接與DNA雙鏈結(jié)合，而是通過(guò)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用，結(jié)合細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子或影響細(xì)胞漿內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，直接或間接地作用于靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，實(shí)現(xiàn)其反式激活功能[13]。

既往研究表明，在HCC組織中存在頻繁的HBx基因3′端缺失突變，導(dǎo)致HBx蛋白羧基端氨基酸不同數(shù)目的缺失。對(duì)這些缺失突變體功能研究顯示,氨基酸缺失的數(shù)目和位置不同，對(duì)HBx蛋白活性的影響也不同。Ritter等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白C末端第149～154aa或N末端第2～30aa缺失不影響HBx的活性；而C末端的106～154aa或N末端1～9aa缺失，HBx的活性完全喪失；N末端3～66aa缺失，HBx的活性明顯下降。因此認(rèn)為，HBx蛋白的3～66aa和106～148aa是其功能域。Arii等[15]認(rèn)為，HBx蛋白的3個(gè)區(qū)域(46～52aa、61～69aa、132～139aa)是其反式激活功能所必需的。Yoo等[16]認(rèn)為，HBx蛋白的氨基端缺失對(duì)其反式激活功能影響不大，而羧基端缺失會(huì)使其嚴(yán)重喪失反式激活功能。HBx的缺失突變讓野生型HBx促細(xì)胞凋亡的能力消失，其反式激活功能受到抑制，其功能區(qū)域在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化間的平衡改變，導(dǎo)致肝細(xì)胞單克隆性無(wú)控生長(zhǎng)。

我們發(fā)現(xiàn)的HBx自然缺失突變體缺失了羧基端129～154aa，正好包含了132～139aa區(qū)域，與功能域106～148aa一致。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自然缺失突變體HBx-128w能顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖能力、克隆形成能力、遷移侵襲能力及體外成瘤能力，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，HBx-128w促進(jìn)細(xì)胞由G1期到S期的進(jìn)程。Zhang等[17]亦從人HCC組織中發(fā)現(xiàn)了HBx的自然缺失突變體，其羧基端氨基酸128～154aa缺失。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變型HBx蛋白能增強(qiáng)細(xì)胞增殖，與本研究結(jié)果一致；他們還發(fā)現(xiàn)，突變型HBx蛋白失去了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，這可能是HBx缺失突變體促進(jìn)HCC發(fā)生的原因之一。Ma等[18]研究了羧基端缺失121～154aa的HBx蛋白功能，認(rèn)為該節(jié)段HBx蛋白通過(guò)激活細(xì)胞增殖在HCC癌變中發(fā)揮重要作用，并且比野生型HBx更能有效轉(zhuǎn)化正常肝細(xì)胞系MIHA。這與我們的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，野生型HBx亦能增強(qiáng)SMMC-7721細(xì)胞的增殖活性、增殖能力、侵襲能力及體外成瘤能力，同樣能促進(jìn)細(xì)胞由G1期到S期的進(jìn)程，但是缺失突變體HBx-128w的作用較之更顯著。提示野生型HBx蛋白的持續(xù)高表達(dá)可能通過(guò)加速肝細(xì)胞凋亡從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞再生以及基因突變的積累，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[19]。此外，HBx蛋白的持續(xù)高表達(dá)可以激活宿主體內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與HCC的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，人HCC組織內(nèi)普遍存在異質(zhì)性的HBx，即可同時(shí)檢測(cè)到野生型和突變型HBx[3]。因此，不排除二者協(xié)同作用，共同促進(jìn)HCC的發(fā)生。

綜上所述，野生型HBx蛋白和缺失突變體HBx-128w均能促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的惡性轉(zhuǎn)化，在HCC發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。HBx蛋白的羧基端129～154aa區(qū)域是其重要功能區(qū)域，該區(qū)域的缺失使缺失突變型HBx蛋白發(fā)揮不同于野生型HBx蛋白的生物學(xué)功能，二者可能在HCC的不同發(fā)展階段發(fā)揮作用，共同促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。未來(lái)我們將借助芯片技術(shù)研究二者在調(diào)控的靶基因及LncRNA方面的差異，進(jìn)一步篩選差異表達(dá)基因，尋找治療HCC的合適靶點(diǎn)。