石圓圓，仇長(zhǎng)宇，聶闖，宮玉波，李雨心，羅靈

戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心，北京100101

晶狀體是人體中對(duì)放射最敏感的組織之一[1]。既往研究認(rèn)為,放射性白內(nèi)障產(chǎn)生的閾值為2 Gy，近年研究認(rèn)為，放射性白內(nèi)障的發(fā)生可能低于此閾值，甚至是隨機(jī)事件[2，3]。而隨著電離輻射技術(shù)的廣泛應(yīng)用，職業(yè)性放射性白內(nèi)障仍不時(shí)發(fā)生[4～6]，但放射性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制仍不明確。既往研究提示，γ-射線照射可致大鼠晶狀體中多種晶狀體蛋白發(fā)生過(guò)氧化，可溶性蛋白含量減少[7～12]。目前普遍認(rèn)為晶狀體蛋白異常聚合形成不溶的復(fù)合物從而形成混濁是先天和老年性白內(nèi)障發(fā)生的主要原因[13]。因此晶狀體蛋白的異常聚合可能存在于放射性白內(nèi)障的形成過(guò)程中。羊毛甾醇可在體外抑制晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)內(nèi)多種已知的先天性白內(nèi)障突變基因編碼的蛋白聚集，從而抑制甚至逆轉(zhuǎn)白內(nèi)障的形成。并且玻璃體腔注射羊毛甾醇可逆轉(zhuǎn)自然發(fā)生的狗的白內(nèi)障，增加透明性[14]。羊毛甾醇能否在X射線引起的放射性晶狀體損傷中發(fā)揮抑制晶狀體蛋白的聚集作用，從而抑制白內(nèi)障形成，目前尚無(wú)相關(guān)研究。2017年1月—2018年7月，我們探討了羊毛甾醇對(duì)X射線照射后大鼠晶狀體混濁形成的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性SD大鼠[350～400 g，許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010]；SRA01/04 人LEC細(xì)胞株(美國(guó) ATCC)；M199培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco)，羊毛甾醇(美國(guó)Sigma)，DMSO(上海Solarbio)，RIPA裂解液試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，BCA試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，胎盤藍(lán)(美國(guó)Sigma)；體式顯微鏡(德國(guó)Catl Zeiss Stemi 305)，Clinac 600C/D直線加速器(美國(guó)Varian)，離心機(jī)(美國(guó) Beckman)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Rio-Rad)。

1.2 大鼠晶狀體體外培養(yǎng) 選取8周齡SD大鼠，以頸椎脫臼法處死后，摘除眼球，剔除肌肉、筋膜等組織，安爾碘浸泡5 min，生理鹽水沖洗3次，將眼球浸于M199培養(yǎng)液中，體式顯微鏡下自后極部剪開鞏膜壁，取出晶狀體，盡量去除晶狀體表面的玻璃體，將晶狀體放入24孔板中培養(yǎng)，每孔加入1 mL 的含有5×104U/L青霉素和5×104U/L鏈霉素的M199培養(yǎng)液。于37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后棄去混濁晶狀體，留取透明晶狀體備用。

1.3 晶狀體X射線照射及分組 晶狀體于培養(yǎng)板中用X線加速器進(jìn)行X射線照射，根據(jù)照射劑量分為分為0 Gy組、2 Gy組、4 Gy組、8 Gy組，每組3枚晶狀體。于照射后1、3、5、7 d在體式顯微鏡下觀察晶狀體變化，并拍照記錄。每48小時(shí)換液。另設(shè)8 Gy-羊毛甾醇組，于照射后即刻加入羊毛甾醇溶液(羊毛甾醇預(yù)先用DMSO溶解成混懸液，終濃度為40 μmol/L)。同時(shí)為除外滲透壓或DMSO本身的影響，設(shè)立8 Gy-DMSO對(duì)照組，即照射后加入與羊毛甾醇組相同量的DMSO。

1.4 晶狀體混濁度觀察及計(jì)算 晶狀體于培養(yǎng)板中，在體式顯微鏡下照相，照相背景為黑色，照相時(shí)使用相同放大倍率。圖片中黑色代表晶狀體透明，灰白色代表混濁。為定量分析羊毛甾醇干預(yù)效果，對(duì)8 Gy各組各時(shí)間點(diǎn)使用Image Pro Plus(IPP)軟件計(jì)算灰度值，灰度數(shù)值越高，代表晶狀體的混濁程度越重。

1.5 晶狀體總可溶性蛋白濃度測(cè)定 對(duì)0 Gy組、8 Gy組、8Gy-DMSO組和8Gy-羊毛甾醇組于培養(yǎng)第1、3、5、7天進(jìn)行蛋白抽提，每組3枚晶狀體。按照裂解液試劑盒說(shuō)明提取蛋白。主要步驟：將晶狀體用300 μL裂解液于1.5 mL EP管中勻漿裂解，其后加入200 μL裂解液，冰上靜置10 min。置離心機(jī)中(4 ℃下，15 000 r/min，15 min)離心取上清。按照BCA試劑盒方法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述上清液稀釋40倍后加入96孔板中，各孔加入BCA工作液后，37 ℃下溫浴30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品孔在540 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔蛋白濃度。

1.6 人LEC培養(yǎng)及X射線照射 采用SRA01/04 LEC細(xì)胞株以8.0×104/孔細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)36 h后達(dá)到90%融合，分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組；于室溫下用X線加速器照射，照射總劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy、8 Gy，照射后更換新完全培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。照射后實(shí)驗(yàn)組立即加入1%DMSO溶解的羊毛甾醇，羊毛甾醇終濃度為40 μmol/L，對(duì)照組僅加入等量的DMSO。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各為4個(gè)復(fù)孔。

1.7 LEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及活細(xì)胞百分率計(jì)算 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及死亡情況，照射后72 h每組選一孔行臺(tái)盼藍(lán)染色檢查計(jì)算活細(xì)胞百分率。

1.8 人LEC中總可溶性蛋白濃度測(cè)定 照射后72 h對(duì)各孔細(xì)胞進(jìn)行蛋白抽提及進(jìn)行總的可溶性蛋白濃度測(cè)定。主要步驟：吸去培養(yǎng)液，每孔細(xì)胞加4 ℃預(yù)冷的PBS 0.01 mol/L(pH 7.2～7.3),洗滌2次。將PBS棄凈后每孔細(xì)胞加50 μL的RIPA裂解液，搖勻后于冰上裂解10 min。將細(xì)胞碎片和裂解液移至0.5 mL離心管中。于4 ℃下12 000 r/min離心5 min，將上清液提取用于蛋白濃度測(cè)定。按照BCA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。主要步驟：首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將10 μL樣品加入96孔板的樣品孔中，補(bǔ)加PBS至20 μL。各孔加入BCA工作液，37 ℃放置30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品孔在540 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各孔蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)晶狀體變化 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，未經(jīng)照射即0 Gy組大鼠晶狀體基本保持透明，至第7天僅出現(xiàn)輕微皮質(zhì)混濁；2 Gy組晶狀體于照射后第5天開始出現(xiàn)輕度皮質(zhì)混濁；4 Gy組晶狀體于照射后第3天開始出現(xiàn)部分的輕度皮質(zhì)混濁，第5天出現(xiàn)較為明顯的不均勻皮質(zhì)混濁；8 Gy組晶狀體及8 Gy-DMSO組于照射后部分晶狀體于第1天即開始出現(xiàn)局部的輕度皮質(zhì)混濁，第3天不均勻混濁繼續(xù)加重，第5天至第7天出現(xiàn)明顯的彌漫皮質(zhì)混濁。8 Gy-羊毛甾醇組照射后第1天及第3天混濁不明顯，第5天出現(xiàn)彌漫混濁，第7天混濁進(jìn)一步加重。因此，隨照射劑量的增加，晶狀體混濁出現(xiàn)更早，程度更重；8 Gy-羊毛甾醇組較8 Gy組及8 Gy-DMSO組出現(xiàn)混濁時(shí)間延遲。8 Gy組、8 Gy-DMSO組、8 Gy-羊毛甾醇組各時(shí)點(diǎn)灰度值比較見(jiàn)表1。

表1 8 Gy組、8 Gy-DMSO組、8 Gy-羊毛甾醇組不同時(shí)點(diǎn)灰度值比較

2.2 各組照射后不同時(shí)點(diǎn)晶狀體總可溶性蛋白含量比較 0 Gy組、8 Gy組、8 Gy-DMSO組及8 Gy羊毛甾醇組不同時(shí)點(diǎn)晶狀體總可溶性蛋白含量比較見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)晶狀體總可溶性蛋白含量比較

2.3 照射72 h后LEC細(xì)胞形態(tài)及活細(xì)胞百分率 照射72 h后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞百分率為90%。照射后細(xì)胞在96 h開始出現(xiàn)明顯死亡。

2.4 兩組不同照射劑量晶狀體上皮細(xì)胞中總可溶性蛋白含量比較 經(jīng)0、2、4、8 Gy照射后72 h晶狀體上皮細(xì)胞中總可溶性蛋白含量比較見(jiàn)表3。

表3 兩組不同照射劑量晶狀體上皮細(xì)胞中可溶性蛋白含量比較

3 討論

白內(nèi)障形成的機(jī)制一直未闡明，有觀點(diǎn)認(rèn)為先天性、老年性白內(nèi)障發(fā)生的機(jī)制為各種原因?qū)е戮铙w蛋白聚合成不溶的大分子量復(fù)合物，從而形成晶狀體內(nèi)光散射和混濁[7]。晶狀體蛋白是人類晶狀體細(xì)胞漿中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在晶狀體可溶性蛋白中約占90%。它與周圍的細(xì)胞骨架蛋白相互結(jié)合，整齊排列，保持晶狀體的透明性[8]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)羊毛甾醇通過(guò)抑制晶狀體蛋白聚集或解聚已聚集的晶狀體蛋白，可以預(yù)防或治療白內(nèi)障[14～16]，是白內(nèi)障藥物治療的重大突破。并且在人白內(nèi)障標(biāo)本中亦發(fā)現(xiàn)羊毛甾醇合酶活性與皮質(zhì)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度有相關(guān)性[15]。

研究顯示放射也可引起動(dòng)物晶狀體內(nèi)蛋白含量和結(jié)構(gòu)的改變。Abdelkawi[7]發(fā)現(xiàn)，用γ射線對(duì)8周齡Wistar大鼠行單次或分次總劑量為4 Gy全身照射時(shí)，24 h后即可觀察到總可溶性蛋白含量降低40%左右，其中α、β和γ晶狀體蛋白均出現(xiàn)含量和分子質(zhì)量的改變。在蛋白結(jié)構(gòu)上，射線照射會(huì)造成晶狀體蛋白的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生氧化，分子伴侶功能發(fā)生下降，從而促進(jìn)蛋白的聚集[10,12]。此外，基于羊毛甾醇及羊毛甾醇合酶已被證實(shí)存在于大鼠晶狀體組織中[17]，即具有作用于晶狀體組織的分子基礎(chǔ)，我們?cè)O(shè)計(jì)觀察了羊毛甾醇在X射線照射大鼠晶狀體或人LEC中的作用。

為能夠連續(xù)并直觀地觀察晶狀體混濁變化情況，我們選用了體外培養(yǎng)晶狀體的方法。實(shí)驗(yàn)觀察到X射線可促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠晶狀體混濁的發(fā)生發(fā)展，且隨照射劑量的增加，晶狀體混濁發(fā)生越早，混濁愈重。其中，8 Gy劑量下在照射后第1天晶狀體就會(huì)發(fā)生局部輕度混濁，第3天就開始出現(xiàn)較為明顯的混濁，并且在7 d的觀察時(shí)間框內(nèi)發(fā)展為嚴(yán)重的晶狀體全混濁。而2 Gy和4 Gy劑量時(shí)晶狀體混濁出現(xiàn)時(shí)間較晚，且程度發(fā)展不一。為便于觀察羊毛甾醇的抑制效果，我們選擇予8 Gy劑量照射的晶狀體加入羊毛甾醇溶液。結(jié)果顯示，加入羊毛甾醇的晶狀體在照射后第3天時(shí)明顯較對(duì)照晶狀體的透明度高，即混濁發(fā)生時(shí)間延遲2 d。此外，對(duì)晶狀體內(nèi)可溶性蛋白含量測(cè)定顯示，羊毛甾醇組可溶性蛋白含量，高于對(duì)照組，并且羊毛甾醇組可溶性蛋白在第5天方出現(xiàn)明顯降低，而對(duì)照組在第3天已出現(xiàn)明顯降低，即可溶性蛋白含量降低羊毛甾醇組遲于對(duì)照組。這提示羊毛甾醇可抑制晶狀體混濁的發(fā)展，并可以抑制放射性晶狀體損傷中可溶性蛋白含量的減少。但同時(shí)，應(yīng)注意到羊毛甾醇組可溶性蛋白含量仍低于0 Gy組，并且羊毛甾醇組在照射后第5天和第7天晶體混濁程度與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示羊毛甾醇并不能完全阻止晶狀體混濁的發(fā)展。我們認(rèn)為這可能與放射性白內(nèi)障損傷的復(fù)雜性有關(guān)。晶狀體透明性的維持，除了需細(xì)胞內(nèi)晶狀體蛋白保持可溶性以外，尚需要細(xì)胞的規(guī)則排列。既往研究發(fā)現(xiàn)射線除造成蛋白的氧化損傷以外，還會(huì)直接造成晶狀體上皮細(xì)胞的DNA破壞，造成細(xì)胞分化異常及細(xì)胞死亡，從而破壞晶狀體細(xì)胞的規(guī)則排列[8]；此外放射可造成自由基產(chǎn)生，谷胱甘肽降低，使得氧化和抗氧化失衡，亦會(huì)加重細(xì)胞膜的損害[7,9]。這些復(fù)雜的因素共同促進(jìn)了放射性白內(nèi)障的形成。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中曾設(shè)置加入400 μmol羊毛甾醇的觀察組，但因羊毛甾醇易溶于有機(jī)溶劑[18]，水溶性極差，高濃度羊毛甾醇溶液形成混懸液，有明顯較大顆粒物質(zhì)。將其加入晶狀體培養(yǎng)液后，培養(yǎng)液亦呈混濁外觀，有大顆粒懸浮，影響晶體外觀的觀察。并且也并未發(fā)現(xiàn)其有明顯的抑制混濁形成的作用。分析原因，考慮較高的藥物濃度可能帶來(lái)滲透壓改變，并且在轉(zhuǎn)運(yùn)或移動(dòng)培養(yǎng)板過(guò)程中，大顆粒物質(zhì)與晶狀體之間可能發(fā)生機(jī)械性摩擦，從而可能反而產(chǎn)生促進(jìn)白內(nèi)障的發(fā)生的作用。

進(jìn)一步我們分析了X射線照射人LEC后72 h的可溶性晶狀體蛋白含量。結(jié)果顯示隨照射劑量的增加，可溶性晶狀體蛋白含量逐漸降低。而羊毛甾醇可抑制LEC中可溶性蛋白含量的減少。此外我們觀察到照射細(xì)胞后96 h開始出現(xiàn)細(xì)胞死亡，聯(lián)系在晶狀體體外培養(yǎng)模型中照射3 d后晶狀體混濁可見(jiàn)加速發(fā)展的現(xiàn)象，細(xì)胞死亡可能參與這一過(guò)程。

綜上所述，羊毛甾醇可抑制X射線照射誘導(dǎo)的晶狀體混濁的發(fā)生，其機(jī)制可能為通過(guò)降低晶狀體可溶性蛋白的丟失實(shí)現(xiàn)。