潘忠玉, 莫夏娜, 孟 香, 陳 敏

(北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100083)

昆蟲與植物在長期協(xié)同進(jìn)化中形成了相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。植物為植食性昆蟲提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，也進(jìn)化出一系列物理和化學(xué)防御機(jī)制來抵抗昆蟲的取食。其中，植物次生代謝物在抵御昆蟲的取食中發(fā)揮著重要作用(欽俊德和王琛柱, 2001; Rani and Jyothsna, 2010; Gong and Zhang, 2014)。植物次生代謝物質(zhì)種類多樣，而酚類是植物重要的次生代謝物質(zhì)之一(徐正浩等, 2004)。不少研究證明，一些植物酚類次生代謝物質(zhì)如綠原酸、單寧酸等會(huì)對(duì)昆蟲的取食、生長、發(fā)育以及繁殖等活動(dòng)產(chǎn)生不利影響，有的甚至具有直接毒殺作用(張時(shí)妙等, 2005; 王曉麗等, 2014)。

在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，昆蟲也形成了行為、生理生化等機(jī)制來應(yīng)對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的脅迫，如不少昆蟲在代謝過程中就能夠以不同的解毒機(jī)制對(duì)抗寄主植物中的有毒物質(zhì)(Felton and Tumlinson, 2008; 朱香鎮(zhèn)等, 2018)。已有的研究表明，昆蟲解毒相關(guān)蛋白主要有細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450 monooxygenase, CYP450)、羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GSTs)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase, UGT)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters)[簡稱ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)]等(Francisetal., 2005; Winde and Wittstock, 2011; Jinetal., 2018)，這些解毒相關(guān)蛋白通過參與外源有毒物質(zhì)的分解和代謝，從而使昆蟲產(chǎn)生適應(yīng)性(Zhangetal., 2012)。

美國白蛾Hyphantriacunea，屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)，是我國重要的檢疫性害蟲。該蟲原產(chǎn)北美洲(Gomi, 2007; Sullivanetal., 2011)，自1979年在遼寧省丹東市首次被發(fā)現(xiàn)后，目前已經(jīng)擴(kuò)散至我國13個(gè)省(區(qū)、市)共計(jì)598個(gè)縣級(jí)行政區(qū)(國家林業(yè)局2020年第3號(hào)公告)。美國白蛾寄主廣泛，多達(dá)630余種(Sullivan and Ozman-Sullivan, 2012)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，不同寄主植物對(duì)美國白蛾有明顯的影響，該蟲對(duì)桑Morusalba、金銀木Loniceramaackii等不同寄主植物的取食量、選擇率和營養(yǎng)效應(yīng)不同，取食不同寄主植物的美國白蛾幼蟲體內(nèi)的AchE, GSTs, CarE和 CYP450 的活性也存在顯著差異(李路莎等, 2018)。我們認(rèn)為，寄主植物的次生代謝物可能在其中發(fā)揮重要作用，然而，不同寄主植物所含次生代謝物質(zhì)的種類組成及含量各異，逐一研究明確各種次生代謝物的影響往往存在較大困難。

綠原酸(chlorogenic acid, C16H18O9, 分子量354.31)屬正雙羥基酚類化合物，是植物中常見的一種次生代謝物，從高等雙子葉植物到蕨類植物均有報(bào)道(高錦明等, 1999)。綠原酸在美國白蛾的喜食寄主桑中的含量較低(0.39%～1.02%)(孫蓮等, 2003; 郝靜怡等, 2019)，在其非喜食的寄主植物金銀木中含量則較高(3.366%)(朱成姣等, 2016)，在非寄主植物杜仲Eucommiaulmoides中含量可高達(dá)4.07%(張康健等, 1999)，這寓示綠原酸在影響美國白蛾對(duì)寄主植物的取食策略中可能發(fā)揮著重要作用。目前已有研究表明綠原酸對(duì)昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，甚至可在昆蟲體內(nèi)可被氧化為毒性更高的醌類物質(zhì)，對(duì)昆蟲產(chǎn)生直接毒殺作用(胡增輝等, 2009; Kundu and Vadassery, 2019)。王曉麗(2014)發(fā)現(xiàn)舞毒蛾Lymantriadispar幼蟲取食含有單寧酸、綠原酸的人工飼料后不能完成正常的生長發(fā)育，幼蟲體重比對(duì)照低約67.2%～75.0%，幼蟲歷期延長2～4倍，蛻皮受阻，至4齡時(shí)全部死亡。谷實(shí)夜蛾Helicoverpazea在攝取含綠原酸和咖啡酸人工飼料后，發(fā)育歷期明顯延長(Summers and Felton, 1994)。舞毒蛾幼蟲取食含綠原酸人工飼料后羧酸酯酶CarE活性隨著時(shí)間呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，但始終比取食正常人工飼料的酶活性強(qiáng)(劉海晶, 2016)。然而，有關(guān)綠原酸對(duì)美國白蛾生長發(fā)育和生理代謝的影響尚不得而知。有鑒于此，本研究通過在人工飼料中添加不同濃度的綠原酸飼養(yǎng)美國白蛾幼蟲，比較和分析綠原酸對(duì)該蟲營養(yǎng)效應(yīng)、生長發(fā)育和解毒相關(guān)蛋白活性的影響，以期為深入探究美國白蛾的寄主適應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲及飼養(yǎng)條件

研究中所用的美國白蛾試蟲為實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)種群。將美國白蛾初孵幼蟲轉(zhuǎn)入含有人工飼料的養(yǎng)蟲杯中，置于昆蟲培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度25±1℃，相對(duì)濕度73%，光周期16L∶8D)飼養(yǎng)。美國白蛾人工飼料配制以及飼養(yǎng)條件采用曹利軍等(2014)。

1.2 人工飼料及綠原酸濃度處理設(shè)置

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中美國白蛾不同寄主植物中的綠原酸濃度，其喜食寄主植物桑中濃度為0.39%～1.02%，非喜食寄主金銀木中濃度為3.366%(孫蓮等, 2003; 朱成姣等, 2016; 郝靜怡等, 2019)，則研究中設(shè)置人工飼料中綠原酸的濃度梯度(m/m)分別為0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%。制作人工飼料期間，將所有主要材料在液態(tài)條件下混合(約65℃)，將0.4 g綠原酸(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)用5 mL 10%二甲基亞砜(DMSO)于室溫下溶解后，加入15 g人工飼料中配置成2.000%綠原酸人工飼料，相同方法配制其余濃度綠原酸飼料，以添加5 mL 10% DMSO的人工飼料為對(duì)照組。

1.3 不同濃度綠原酸處理美國白蛾幼蟲的死亡率測(cè)定

根據(jù)美國白蛾特性，5齡幼蟲食量大，生長發(fā)育旺盛，且腸道易于解剖，適宜進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定。選取生長發(fā)育一致的5齡健康幼蟲，饑餓12 h后轉(zhuǎn)入不同濃度(0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%)的綠原酸人工飼料飼養(yǎng)。以10% DMSO人工飼料飼養(yǎng)的5齡健康幼蟲為對(duì)照。每個(gè)養(yǎng)蟲杯接蟲10頭幼蟲為一個(gè)重復(fù)，每濃度處理設(shè)4個(gè)重復(fù)(即4個(gè)養(yǎng)蟲杯)。飼養(yǎng)條件同1.2節(jié)。每天觀察飼料是否新鮮，不新鮮的及時(shí)更換，并記錄幼蟲死亡情況，為避免老熟幼蟲出現(xiàn)預(yù)化蛹狀態(tài)影響試驗(yàn)結(jié)果，于處理6 d后終止觀察并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。以毛筆輕觸美國白蛾幼蟲蟲體兩次，無反應(yīng)者視為死亡。死亡率(%)=(死亡幼蟲個(gè)體數(shù)/供試幼蟲總數(shù))×100%。

1.4 不同濃度綠原酸處理美國白蛾的營養(yǎng)效應(yīng)測(cè)定

選取生長發(fā)育一致的5齡健康幼蟲，饑餓12 h后，轉(zhuǎn)入不同濃度的綠原酸人工飼料(0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%)飼養(yǎng)，以10%DMSO人工飼料飼養(yǎng)的5齡健康幼蟲為對(duì)照。飼養(yǎng)條件同1.2節(jié)。每個(gè)培養(yǎng)杯接蟲5頭為一個(gè)重復(fù)，每濃度處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

幼蟲取食前稱取人工飼料重量，48 h后取出剩余飼料，饑餓12 h后使幼蟲排出糞便，稱取取食后幼蟲的鮮重。然后將幼蟲、糞便、剩余飼料放入烘箱，80℃下烘干至恒重，分別稱量其干重。此外，在相同環(huán)境下，另外采集取食前人工飼料和剛饑餓處理后的5齡幼蟲，稱取鮮重，進(jìn)行烘干，記作取食前飼料干重和取食前幼蟲干重。根據(jù)飼料含水量和幼蟲含水量推算取食前幼蟲以及投喂飼料干重。依照下列公式計(jì)算各營養(yǎng)指標(biāo)(Waldbauer, 1968)：

近似消化率(AD)(%)=(I-F)/I×100%；

食物利用率(ECI)(%)=G/I×100%；

食物轉(zhuǎn)化率(ECD)(%)=G/(I-F)×100%；

相對(duì)生長速率(RGR)(g/g·d)=G/(B×T)；

相對(duì)取食量(RCR)(g/gd)=I/(B×T)。

式中，G: 蟲體增重(G=取食后幼蟲干重-取食前幼蟲干重);B: 試驗(yàn)期間幼蟲平均體重[B=(取食前幼蟲干重+取食后幼蟲干重)/2];I: 取食量(I=取食前飼料干重-取食后飼料干重);F: 糞便干重;T: 試驗(yàn)天數(shù)。

1.5 0.500%綠原酸處理美國白蛾幼蟲的生長發(fā)育指標(biāo)測(cè)定

參照王曉麗等(2014)的方法，以及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，美國白蛾低齡(1和2齡)幼蟲對(duì)綠原酸非常敏感，即使采用較低濃度的綠原酸(0.250%)，試蟲均很快死亡，無法完成各項(xiàng)生長發(fā)育指標(biāo)的數(shù)據(jù)采集，所以將生長發(fā)育一致的3齡健康幼蟲饑餓12 h后，轉(zhuǎn)入含0.500%綠原酸的人工飼料飼養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置含10% DMSO的人工飼料飼養(yǎng)的3齡幼蟲作對(duì)照組。每30頭幼蟲(飼養(yǎng)于一個(gè)養(yǎng)蟲杯)為一個(gè)重復(fù)，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，處理前稱量每個(gè)處理的幼蟲平均體重，第一次蛻皮后，將幼蟲轉(zhuǎn)移到新的養(yǎng)蟲杯內(nèi)，一杯1蟲，單頭飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件同1.2節(jié)。每天觀察并記錄幼蟲的發(fā)育情況，包括蛻皮、化蛹、死亡等。羽化后，將雌雄成蟲轉(zhuǎn)移到紗網(wǎng)籠內(nèi)進(jìn)行自由交配、產(chǎn)卵，對(duì)卵塊進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 不同濃度綠原酸處理美國白蛾的解毒相關(guān)蛋白活性測(cè)定

選取生長發(fā)育一致的5齡健康幼蟲，饑餓12 h后，轉(zhuǎn)入含0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%的綠原酸人工飼料飼養(yǎng)(飼養(yǎng)條件同1.2節(jié))，以含10% DMSO人工飼料飼養(yǎng)的5齡幼蟲為對(duì)照。每個(gè)養(yǎng)蟲杯接蟲5頭為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。飼養(yǎng)36 h后，隨機(jī)挑選試蟲進(jìn)行解剖，取出腸道，用預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH 7.0)，按中腸質(zhì)量(g)∶磷酸緩沖液體積(mL)=1∶9(m/v)的比例進(jìn)行冰浴勻漿，4℃ 8 000 r/min離心10 min后，取上清即為酶原液4℃保存，用于分析食料中不同濃度的綠原酸對(duì)美國白蛾幼蟲各解毒相關(guān)蛋白活性的影響。

用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)測(cè)定試劑盒(YX-W-A204，上海優(yōu)選生物科技有限公司)、羧酸酯酶(CarE)測(cè)定試劑盒(ml036265，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)測(cè)定試劑盒(ml062849)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)測(cè)定試劑盒(ml341674)、細(xì)胞色素P450酶測(cè)定試劑盒(JL22832，上海將來實(shí)業(yè)有限公司)測(cè)定腸道酶源液5種解毒相關(guān)蛋白活性；用蛋白濃度測(cè)定試劑盒(PW0103, BIOMIGA, 美國)測(cè)定腸道酶源液蛋白濃度。各解毒相關(guān)蛋白活性和蛋白定量測(cè)定的具體方法均按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS21.0軟件計(jì)算美國白蛾幼蟲在綠原酸處理下的死亡率、營養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)、生長發(fā)育各項(xiàng)指標(biāo)、解毒相關(guān)蛋白活性的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行分析，以Tukey氏檢測(cè)法比較不同處理間的差異顯著性(P<0.05)，運(yùn)用Origin8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對(duì)美國白蛾5齡幼蟲死亡率的影響

用含不同濃度綠原酸的人工飼料飼喂美國白蛾5齡幼蟲6 d后的死亡率結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，含不同濃度綠原酸的人工飼料飼養(yǎng)美國白蛾5齡幼蟲，3 d后開始出現(xiàn)死亡個(gè)體，死亡高峰期出現(xiàn)在第3-5天之間；6 d后不同濃度綠原酸處理的美國白蛾幼蟲死亡率有顯著差異(F=48.634,P<0.05)，且綠原酸濃度越高，幼蟲的死亡率越高，0.125%綠原酸處理組死亡率為10.00%±4.08%，而2.000%綠原酸處理組死亡率達(dá)到67.50%±4.79%。

圖1 取食含不同濃度綠原酸的人工飼料后美國白蛾5齡幼蟲的死亡率

2.2 綠原酸對(duì)美國白蛾5齡幼蟲營養(yǎng)效應(yīng)的影響

不同濃度綠原酸處理48 h后的美國白蛾5齡幼蟲的營養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)見表1。結(jié)果顯示，不同濃度綠原酸處理的美國白蛾5齡幼蟲的相對(duì)取食量(RCR)和近似消化率(AD)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，食物轉(zhuǎn)化率(ECD)顯著低于對(duì)照組(P<0.05);除0.125%綠原酸處理組外，其余濃度處理組幼蟲的食物利用率(ECI)和相對(duì)生長速率(RGR)也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 取食含不同濃度綠原酸的人工飼料48 h后美國白蛾5齡幼蟲的營養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)

2.3 綠原酸對(duì)美國白蛾幼蟲生長發(fā)育的影響

用含0.500%綠原酸的人工飼料飼養(yǎng)美國白蛾幼蟲(從3齡幼蟲開始)，各齡期發(fā)育歷期情況如表2。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，0.500%綠原酸處理使3-5齡幼蟲的發(fā)育歷期顯著延長28.24%(3.7 d)(P<0.05)，但6和7齡幼蟲的發(fā)育歷期縮短8.97%(0.7 d)，整體延長3-7齡幼蟲的發(fā)育歷期約3.0 d。

表2 0.500%綠原酸對(duì)美國白蛾幼蟲發(fā)育歷期的影響

0.500%綠原酸處理后美國白蛾的其他各項(xiàng)生長發(fā)育指標(biāo)如表3所示。結(jié)果顯示，綠原酸處理組的幼蟲總存活率(66.67%)、化蛹率(90.00%)、成蟲羽化率(81.49%)和雌雄性比(0.29)均明顯低于對(duì)照組，且平均單雌產(chǎn)卵量(429.60±65.35粒)比對(duì)照(707.33±26.78粒)顯著減少(P<0.05)。由此可知，綠原酸對(duì)美國白蛾的生長發(fā)育和繁殖具有負(fù)面影響。

表3 0.500%綠原酸對(duì)美國白蛾5項(xiàng)生長發(fā)育指標(biāo)的影響

2.4 綠原酸對(duì)美國白蛾5齡幼蟲解毒相關(guān)蛋白活性的影響

用含5種不同濃度(0.125%, 0.250%, 0.500%, 1.000%和2.000%)綠原酸的人工飼料分別飼養(yǎng)美國白蛾5齡幼蟲36 h后，腸道內(nèi)5種解毒相關(guān)蛋白的活性如圖2所示。結(jié)果表明，不同濃度的綠原酸對(duì)美國白蛾GSTs(F=97.577,P<0.001)、UGT(F=6.421,P=0.004)、CYP450(F=2.471,P<0.001)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(F=5.761,P=0.006)的活性均有顯著影響。由圖2(A, D, E)可知，綠原酸對(duì)美國白蛾中腸的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, CYP450和GSTs活性均有不同程度的誘導(dǎo)作用且誘導(dǎo)趨勢(shì)相似。隨著綠原酸濃度的升高，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、CYP450和GSTs 3種解毒相關(guān)蛋白的活性也逐漸升高，然后略微降低。當(dāng)綠原酸濃度低于0.250%時(shí)，CYP450酶活性與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；綠原酸濃度為0.500%～2.000%時(shí)，CYP450酶的活性被顯著誘導(dǎo)，在1.000%時(shí)活性達(dá)到最大(12.46 U/L)。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)GSTs活性均被顯著誘導(dǎo)，在綠原酸濃度為1.000%時(shí)GSTs活性達(dá)到最大(34.21 U/mg pro)。在試驗(yàn)濃度內(nèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性也被不同程度誘導(dǎo)且與對(duì)照組差異顯著，當(dāng)綠原酸濃度為0.500%時(shí)，對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性誘導(dǎo)能力達(dá)到最大。0.125%的綠原酸對(duì)美國白蛾UGT的活性具有顯著誘導(dǎo)作用(P<0.05)，而其余濃度處理的UGT活性與對(duì)照相比均無顯著差異(P>0.05)(圖2: B)。而由圖2(C)可知，各濃度綠原酸對(duì)美國白蛾幼蟲CarE活性均未見顯著影響(F=0.166,P=0.970)。

圖2 取食含不同濃度綠原酸的人工飼料36 h后美國白蛾5齡幼蟲腸道中5種解毒相關(guān)蛋白的活性

3 討論

本研究通過在美國白蛾人工飼料中添加不同濃度的綠原酸，調(diào)查了綠原酸對(duì)美國白蛾幼蟲死亡率、營養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)和多項(xiàng)生長發(fā)育指標(biāo)的影響，以及不同濃度綠原酸對(duì)美國白蛾5齡幼蟲5種解毒相關(guān)蛋白活性的影響。綠原酸處理組美國白蛾幼蟲3 d后才開始有個(gè)體死亡，死亡高峰期在第3-5天之間(圖1)，說明綠原酸在本研究的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)美國白蛾不具有急性殺蟲作用，但隨著取食時(shí)間延長，綠原酸可能在幼蟲體內(nèi)積累而發(fā)揮殺蟲作用。王曉麗等(2014)用0.3%綠原酸處理舞毒蛾2齡幼蟲也得到類似結(jié)果，處理20 d后幼蟲死亡率從20%迅速上升到50%，到34 d時(shí)死亡率達(dá)到100%；其他酚類如50 μg/mL山奈酚處理72 h后致倦庫蚊Culexquinquefasciatus4齡幼蟲死亡率達(dá)到82%(黃繼光等, 2014)。

本研究結(jié)果表明，綠原酸處理對(duì)幼蟲的營養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)具有顯著影響，處理組5齡幼蟲的相對(duì)取食量和近似消化率顯著高于對(duì)照組，但是食物轉(zhuǎn)化率、食物利用率和相對(duì)生長速率顯著低于對(duì)照組(表1)?？赡苡捎诰G原酸的存在致使美國白蛾對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用率降低，從而影響其生長發(fā)育。Barbenhenn等(2003)也提出，綠原酸在許多鱗翅目幼蟲中腸的堿性、氧化的環(huán)境內(nèi)，可對(duì)其生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，可能是由于綠原酸被昆蟲的過氧化物酶氧化成氯醌后與氨基酸(組氨酸、半胱氨酸等)結(jié)合，降低氨基酸的生物利用度，從而抑制昆蟲的生長(Kundu and Vadassery, 2019)。研究表明，酚酸物質(zhì)與營養(yǎng)素或酶結(jié)合時(shí)，對(duì)蟲體消化吸收有不利影響(Appel, 1993)。如谷實(shí)夜蛾在攝取定量香豆酸后，相對(duì)生長速率顯著降低(Summers and Felton, 1994)。斜紋夜蛾Spodopteralitura取食1%沒食子酸后，食物利用率顯著降低(黃敏燕和李雪峰, 2018)。本研究中綠原酸處理使美國白蛾幼蟲的相對(duì)取食量和近似消化率上升(表1)，表明美國白蛾可通過提高取食量和食物的消化率來補(bǔ)償對(duì)食物營養(yǎng)利用率低的影響，滿足其生長發(fā)育的營養(yǎng)需求，從而對(duì)食物中一定濃度綠原酸產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。

本研究中用0.500%綠原酸處理的飼料喂食美國白蛾3齡幼蟲，使該蟲化蛹率、羽化率、雌雄性比以及單雌產(chǎn)卵量降低(表3)，表明食物中的綠原酸可對(duì)美國白蛾的生長發(fā)育及繁殖造成負(fù)面影響。綠原酸導(dǎo)致美國白蛾幼蟲(3-5齡)齡期延長，可能是因?yàn)槊绹锥暝诘钟G原酸的過程中產(chǎn)生了適合度代價(jià)，攝入的能量一部分用于生長發(fā)育，而另一部分則消耗用于綠原酸的解毒代謝，而老熟幼蟲(6-7齡)的發(fā)育歷期縮短，可能與美國白蛾傾向于以蛹度過不良環(huán)境，綠原酸處理導(dǎo)致老熟幼蟲提前化蛹等有關(guān)(鄧煜, 2018)。本研究綠原酸降低美國白蛾生長發(fā)育和繁殖力結(jié)果與Osier等(2000)研究舞毒蛾的產(chǎn)卵量與其食料的含酚酸量成反比的結(jié)論相一致，這為Awmack和Leather(2002)提出的昆蟲在長期進(jìn)化的過程中可通過調(diào)節(jié)自身的繁殖能力來適應(yīng)不同適合度的食物的推測(cè)提供了新的證據(jù)。

植物次生代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)植食性昆蟲解毒相關(guān)蛋白活性發(fā)生變化，從而可能提高這類昆蟲的適應(yīng)能力(Hlavica, 2011; 陳澄宇等, 2015)。本研究結(jié)果表明，綠原酸在供試濃度范圍內(nèi)能夠誘導(dǎo)美國白蛾幼蟲的細(xì)胞色素P450酶的活性(圖2)。已有研究證實(shí)CYP450酶能在昆蟲消化道等組織內(nèi)為有毒次生代謝物質(zhì)引入羥基、羧基和氨基等化學(xué)基團(tuán)，提高有毒次生代謝物質(zhì)的水溶性和反應(yīng)活性，降解為毒性更低的形式(Chungetal., 2006; Cuietal., 2016)。供試濃度范圍內(nèi)的綠原酸能夠一定程度上誘導(dǎo)美國白蛾GSTs活性。GSTs通過催化還原性谷胱甘肽(GSH)與有毒的疏水親電物質(zhì)發(fā)生軛和反應(yīng)，使之毒性降低，可溶性增強(qiáng)而排出體外，從而達(dá)到解毒的目的(Firidinetal., 2008)。羧酸酯酶具有廣泛的底物特異性，可以水解羧酸酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵，在對(duì)含酯鍵外源毒物的水解方面起重要作用，也可以作為結(jié)合蛋白與外源毒物不可逆結(jié)合，使其不能達(dá)到靶標(biāo)，從而起到對(duì)外源毒物的隔離作用(Hemingway, 2000)。綠原酸對(duì)舞毒蛾幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶CarE活性起誘導(dǎo)作用(劉海晶, 2016)，但本研究結(jié)果表明綠原酸對(duì)美國白蛾CarE活性沒有顯著影響(圖2)，表明不同昆蟲對(duì)綠原酸的解毒響應(yīng)機(jī)制不同，美國白蛾通過誘導(dǎo)其他解毒相關(guān)蛋白的活性來抵御綠原酸危害。本研究中低濃度的綠原酸對(duì)UGT活性有誘導(dǎo)作用，但相對(duì)高濃度綠原酸對(duì)UGT活性沒有顯著影響；綠原酸對(duì)美國白蛾ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物活性的影響是隨著濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后略微降低趨勢(shì)(圖2)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要在解毒過程第3階段起作用，排出由CYP450和GSTs等解毒相關(guān)蛋白活化共軛連接的毒素復(fù)合物(Jinetal., 2018)。這些結(jié)果表明，綠原酸對(duì)美國白蛾幼蟲體內(nèi)不同解毒相關(guān)蛋白生物活性的影響存在差異，綠原酸的解毒代謝可能需要不同解毒相關(guān)蛋白的協(xié)調(diào)作用才能完成。

本研究針對(duì)綠原酸對(duì)美國白蛾死亡率、營養(yǎng)效應(yīng)指標(biāo)、生長發(fā)育的影響以及解毒相關(guān)蛋白活性的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)綠原酸可影響美國白蛾幼蟲利用食物營養(yǎng)的效率以及解毒相關(guān)蛋白的活性，同時(shí)也對(duì)美國白蛾幼蟲的生長發(fā)育、行為、繁殖等生命活動(dòng)以及子代種群數(shù)量產(chǎn)生不利影響，而美國白蛾幼蟲可以通過調(diào)節(jié)食物的取食量和消化率以及誘導(dǎo)活化解毒相關(guān)蛋白的活性，增強(qiáng)對(duì)綠原酸的代謝能力，從而對(duì)寄主植物中一定含量的綠原酸產(chǎn)生適應(yīng)。本研究將有助于揭示綠原酸的抗蟲作用機(jī)制，以及美國白蛾對(duì)含綠原酸的寄主植物的選擇和適應(yīng)策略，對(duì)于制定和完善美國白蛾的防治策略具有重要的指導(dǎo)作用。