劉佳寧, 秦道正

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 陜西楊凌 712100)

昆蟲的生殖系統(tǒng)是昆蟲繁殖后代、延續(xù)種族的器官，其構(gòu)造和功能是研究昆蟲生殖能力和適應(yīng)性的基礎(chǔ)，與昆蟲種群數(shù)量的消長密切相關(guān)(彩萬志等, 2001; 王蔭長, 2004; Klowden, 2008)。研究昆蟲生殖系統(tǒng)的超微結(jié)構(gòu)特征，不僅可用于近緣類群的分類鑒定，還可以為系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系探討提供重要證據(jù)。

蠟蟬總科(Fulgoroidea)是半翅目(Hemiptera)頭喙亞目(Auchenorrhyncha)中一個較大的類群，目前已記載約1 500屬13 600多種，廣泛分布于世界各大地理區(qū)(宋南和江志毅, 2012; Bourgoin, 2019)。該類群均為植食性，一些種類還可以傳播植物病毒病，是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲(Yangetal., 2015; Zhangetal., 2019)。有關(guān)蠟蟬總科昆蟲雌性生殖系統(tǒng)的整體形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)研究較少，目前僅見Ammar(1985)研究了玉米花翅飛虱Peregrinusmaidis卵巢的超微結(jié)構(gòu)，在發(fā)育的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類菌體；Bourgoin和Huang(1991)以及Bourgoin(1993)明確了蠟蟬亞目昆蟲雌性生殖系統(tǒng)的整體形態(tài)；Bourgoin和O′Brien(1994)研究了蠟蟬科中Odontopteratoulgoeti的雌性生殖系統(tǒng)，提供了內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)圖；D′Urso等(2005)發(fā)現(xiàn)穎蠟蟬科中Cixidiasikaniae每個卵巢有6個卵巢管，卵巢管外有卵巢鞘；Michalik等(2009)和Szklarzewicz等(2007)分別觀察了脈菱蠟蟬Cixiusnervosus、古北飛虱Javesellapellucida和Conomelusanceps卵巢的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)卵子發(fā)生早期的卵母細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞位于滋養(yǎng)體底部，卵泡上皮細(xì)胞環(huán)繞卵母細(xì)胞排列；林江(2011)和林江等(2011)描述了緣蛾蠟蟬Salurnismarginella、八點(diǎn)廣翅蠟蟬Ricaniaspeculum、斑衣蠟蟬Lycormadelicatula和柿廣翅蠟蟬Ricaniasublimata雌性生殖系統(tǒng)，并提供了相應(yīng)的形態(tài)特征圖。此后，有關(guān)蠟蟬總科雌性生殖系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)一直未見報道。

斑衣蠟蟬Lycormadelicatula隸屬蠟蟬總科(Fulgoroidea)蠟蟬科(Fulgoridae)斑衣蠟蟬屬Lycorma，該種原記載于中國，后擴(kuò)散至孟加拉國、印度、越南、日本、韓國等其他亞洲國家，主要危害觀賞喬木和灌木等(Kimetal., 2013; Yangetal., 2014)。近年來還入侵北美，給當(dāng)?shù)氐钠咸鸭肮麡洚a(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重為害(Barringeretal., 2015; Daraetal., 2015)。本研究采用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡技術(shù)，觀察斑衣蠟蟬的雌性生殖系統(tǒng)整體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，旨在明確其主要器官的超微結(jié)構(gòu)特征，為蠟蟬總科昆蟲分類和交配機(jī)制研究提供更多的形態(tài)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

斑衣蠟蟬L.delicatula成蟲于2018年9月采自陜西楊陵(34°29′32″N, 108°6′91″E)，采集的新鮮雌蟲標(biāo)本置于養(yǎng)蟲籠內(nèi)帶回實驗室迅速活體解剖。

1.2 光學(xué)顯微鏡觀察

將活體雌成蟲置于2%磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)(0.1 mol/L, pH 7.2)的凹面載玻片上，在體視顯微鏡(型號: Jiangnan JSZ6)下快速解剖出雌性生殖系統(tǒng)的交配囊、前陰道、后陰道、中輸卵管、受精囊管、受精囊、卵巢和受精囊附腺等，并移入滴有2%磷酸鹽緩沖溶液的凹面皿中，在光學(xué)顯微鏡(型號: Leica M205 A)下觀察并拍照。

1.3 透射電子顯微鏡樣品制備與觀察

用尖頭鑷子將解剖并分離的雌性生殖系統(tǒng)各部分器官放入2.5%戊二醛的2.0 mL離心管中，在4℃冰箱中固定12 h后取出，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.2)漂洗3次，每次15 min;于1%鋨酸溶液4℃條件下固定2 h，再用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.2)漂洗3次，每次10 min;用梯度乙醇(體積比30%, 50%, 70%, 80%, 90%和100%)進(jìn)行逐級脫水,各濃度2次，每次8 min；隨后在2.0 mL離心管中用乙醇/倫敦白膠(LR White樹脂)混合物進(jìn)行3次滲透(3∶1, 1∶1和1∶3，v/v)，時間分別為2, 8和12 h，再用純倫敦白膠包埋劑滲透2次，每次24 h。將樣品膠囊貼好標(biāo)簽放入包埋板內(nèi)，進(jìn)行搖床震蕩，最后用純倫敦白膠包埋劑進(jìn)行包埋，在55℃烘箱內(nèi)聚合48 h。

將制作好的膠粒用修塊機(jī)(型號: Leica EM Trim2)進(jìn)行樣品修整，用Leica EM UC7型超薄切片機(jī)進(jìn)行半薄定位和超薄切片(厚度約為75 nm)，置于80目的銅網(wǎng)上，然后用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色(分別為10和20 min)，在TECNAI G2 SPIRIT BIO型透射電子顯微鏡80 kV下進(jìn)行觀察和拍照，獲取的圖片用Adobe Photoshop CS6進(jìn)一步處理。

2 結(jié)果

2.1 雌性生殖系統(tǒng)整體形態(tài)

斑衣蠟蟬雌性生殖系統(tǒng)主要包括1對卵巢、1個中輸卵管、1個交配囊、1個交配囊管、1個前陰道、1個后陰道、1個受精囊、1個受精管和2根受精囊附腺(圖1)。2個卵巢發(fā)達(dá)對稱，呈端滋式。交配囊膨大呈長圓形，下方連接交配囊管，交配囊管再與后陰道相連。前陰道連接后陰道和受精管，受精囊管末端膨起形成橢圓狀的受精囊，中輸卵管開口于前陰道側(cè)腹部，受精囊附腺細(xì)長管狀，其一端著生在受精囊尾部，另一端附著在交配囊上。

圖1 斑衣蠟蟬雌成蟲生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

2.2 雌性生殖系統(tǒng)超微形態(tài)

交配囊膨大呈圓球狀。交配囊的囊壁由上皮細(xì)胞、肌肉層和基膜組成(圖2: A)。肌肉層呈石塊狀整齊排列，上皮細(xì)胞核明顯，具分泌顆粒，細(xì)胞層內(nèi)有大量囊泡結(jié)構(gòu)和少量的基膜內(nèi)折(圖2: A, B)。交配囊的囊腔中可見一些分泌物質(zhì)和精子(圖2: C, D)。

圖2 斑衣蠟蟬雌成蟲交配囊

交配囊管呈圓柱狀，連接交配囊和后陰道，由肌肉鞘、上皮細(xì)胞層和管腔組成，上皮細(xì)胞核突出，存在基膜內(nèi)折，微氣管連接細(xì)胞基膜(圖3: A, B)，肌肉鞘內(nèi)有大量的囊泡結(jié)構(gòu)(圖3: C)；橫切圖顯示管壁內(nèi)微絨毛密集(圖3: D)，分布有大量的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)(圖3: E, F)。

圖3 斑衣蠟蟬雌成蟲交配囊管

后陰道位于交配囊管下方，圓管狀，靠近上皮細(xì)胞處的微氣管結(jié)構(gòu)連接細(xì)胞層(圖4: A)。管腔內(nèi)存在大量微絨毛，其邊緣分布有分泌顆粒(圖4: B)；大量的分泌顆粒和線粒體環(huán)繞于上皮細(xì)胞核周圍(圖4: C, D)。后陰道由上皮細(xì)胞層、肌肉鞘和管腔構(gòu)成(圖4: D)。

圖4 斑衣蠟蟬雌成蟲后陰道

前陰道與后陰道末端相連，管狀，端部延伸至中輸卵管。前陰道由肌肉鞘、基膜、上皮細(xì)胞層和管腔組成，微氣管以基膜連接肌細(xì)胞層，并形成內(nèi)折與肌肉鞘相連(圖5: A, B)；上皮細(xì)胞層內(nèi)充滿囊泡結(jié)構(gòu)(圖5: C)，上皮細(xì)胞核周圍環(huán)繞著大量的線粒體結(jié)構(gòu)(圖5: D)。

圖5 斑衣蠟蟬雌成蟲前陰道

中輸卵管位于前陰道側(cè)腹部，由中輸卵管腔、上皮細(xì)胞、肌肉鞘和基膜組成(圖6: A)；上皮細(xì)胞核周圍存在大量線粒體結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞層內(nèi)充滿囊泡結(jié)構(gòu)(圖6: B, C)；肌肉層厚且發(fā)達(dá)，管壁外有微氣管，連接肌肉鞘和基膜(圖6: D)。

受精管從中輸卵管末端延伸至受精囊，上皮細(xì)胞間有少量的基膜內(nèi)折(圖7: A)；肌細(xì)胞間隙明顯且邊界清楚，存在囊泡結(jié)構(gòu)(圖7: B)；管腔內(nèi)有大量層狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu)，以及一些腔內(nèi)分泌物(圖7: C)；肌細(xì)胞交錯排列，存在層狀體(圖7: D)，受精管壁由基膜、厚層肌肉鞘和管腔組成(圖7: E)。

圖7 斑衣蠟蟬雌成蟲受精管

受精囊為受精管近末端略膨大的囊狀結(jié)構(gòu)，由肌肉鞘、基膜、上皮細(xì)胞和囊腔構(gòu)成，囊壁由較厚的肌肉層組成(圖8: A, B)。肌肉鞘細(xì)胞間由微氣管相連，靠近管腔處為上皮細(xì)胞層(圖8: A, B)；上皮細(xì)胞層邊緣環(huán)繞大量微絨毛，內(nèi)部布滿線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)(圖8: C, D)。受精囊腔中散布大量精子結(jié)構(gòu)和角質(zhì)層(圖8: E)。

圖8 斑衣蠟蟬雌成蟲受精囊

卵室由固有膜、濾泡細(xì)胞和卵細(xì)胞組成(圖9: A, B)。中下部的滋養(yǎng)細(xì)胞中有合胞體(圖9: C)，其細(xì)胞核又分化為滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母細(xì)胞的細(xì)胞核。卵室內(nèi)充滿形狀不規(guī)則的滋養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞周圍存在內(nèi)共生細(xì)菌(圖9: C, D)。卵細(xì)胞間存在細(xì)胞間隙，細(xì)胞核外分布著大量線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)(圖9: E)。

圖9 斑衣蠟蟬雌成蟲卵巢

受精囊附腺著生于受精囊末端，為均勻的螺旋管狀，主要由肌肉層、上皮細(xì)胞層和中心管腔組成(圖10: A)；上皮細(xì)胞層內(nèi)有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和圓形分泌顆粒(圖10: B)，受精囊附腺管腔內(nèi)基膜內(nèi)折，有囊泡結(jié)構(gòu)(圖10: C)；分泌細(xì)胞前體物質(zhì)外圍環(huán)繞一些顆粒物，內(nèi)部主要是絲狀物質(zhì)(圖10: D)。

圖10 斑衣蠟蟬雌成蟲受精囊附腺

3 討論

斑衣蠟蟬與蠟蟬總科(Fulgoroidea)中其他已報道類群的雌性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)相似，均由卵巢、中輸卵管、交配囊、交配囊管、前陰道、后陰道、受精囊、受精管和受精囊附腺等部分構(gòu)成，但不同類群的卵巢小管數(shù)目存在差異，如：中華彩象蠟蟬Dictyopharasinica[隸屬象蠟蟬科(Dictyopharidae)]的卵巢有6個卵巢小管，緣蛾蠟蟬S.marginella[隸屬蛾蠟蟬科(Flatidae)]有8個卵巢小管，山東寬廣蠟蟬Pochaziashantungensis、八點(diǎn)廣翅蠟蟬R.speculum、透明疏廣蠟蟬Euricaniaclara[隸屬廣蠟蟬科(Ricaniidae)]有12個卵巢小管(林江, 2011)。本研究觀察到斑衣蠟蟬的卵巢由14個卵巢小管組成?？梢姡菩陨诚到y(tǒng)卵巢小管數(shù)目在不同科間有差異。林江(2011)和林江等(2011)觀察了斑衣蠟蟬的雌性生殖系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)，本文為了全面起見，也提供了該種雌性生殖系統(tǒng)的整體形態(tài)特征圖。在此基礎(chǔ)上，本研究首次對卵巢、中輸卵管、交配囊、交配囊管、前陰道、后陰道、受精囊、受精管和受精囊附腺的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和描述。

根據(jù)現(xiàn)有研究，半翅目頭喙亞目中葉蟬總科(Cicadelloidea)和蟬總科(Cicadoidea)昆蟲中輸卵管膨大，受精囊及交配囊呈圓形或橢圓形，精子儲存在受精囊內(nèi)(Bourgoin, 1993; Hayashi and Kamimura, 2002; Hummeletal., 2006; 蘇梅, 2014)；沫蟬總科(Cercopoidea)昆蟲中輸卵管中部略微膨起形成交配囊，受精囊退化，精子儲存在交配囊中(王婷婷, 2015)；角蟬總科(Membracoidea)昆蟲中輸卵管基部著生膨大的受精囊，交配囊退化(鐘海英, 2014)。蠟蟬總科昆蟲的中輸卵管短粗，開口于前陰道，下方連接2根側(cè)輸卵管，交配囊位于后陰道背面，受精囊位于受精囊管近末端，用于儲存精子(Bourgoin, 1993)。本研究發(fā)現(xiàn)斑衣蠟蟬的中輸卵管、交配囊及受精囊與林江(2011)和林江等(2011)有關(guān)廣蠟蟬科(Ricaniidae)、蛾蠟蟬科(Flatidae)和象蠟蟬科(Dictyophoridae)代表種類的中輸卵管、交配囊及受精囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，而不同于蟬總科、葉蟬總科和沫蟬總科的種類。這是否是蠟蟬總科昆蟲的獨(dú)有特征需要進(jìn)一步研究。此外，本研究觀察的斑衣蠟蟬受精囊壁的超微結(jié)構(gòu)以及在囊腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)單個游離精子，與葉蟬總科和蝎蛉科昆蟲Panorpasexspinosa和Panorpajilinensis受精囊壁的組成和囊內(nèi)的精子分布狀態(tài)相似(Hayashi and Kamimura, 2002; 馬娜, 2012; 蘇梅, 2014)，進(jìn)一步證實了受精囊為昆蟲儲存精子的重要場所。斑衣蠟蟬交配囊內(nèi)存在游離精子和分泌物質(zhì)，說明交配囊是雌雄蟲交配的場所，雄蟲的精子在交配囊中短暫貯存及活化，這與已報道的頭喙亞目昆蟲以及其他類群交配囊結(jié)構(gòu)功能一致(Hayashi and Kamimura, 2002; Hummeletal., 2006; 王婷婷, 2015)。

雌性昆蟲常具雌性附腺和受精囊附腺(Leopold and Degrugillier, 1973; Leopoldetal., 1978; Degrugillier, 1985; 彩萬志等, 2001)。半翅目頭喙亞目中葉蟬總科和沫蟬總科雌成蟲雌性附腺為1根粗細(xì)均勻的管狀結(jié)構(gòu)，與交配囊相連，受精囊附腺不發(fā)達(dá)(蘇梅, 2014; 王婷婷, 2015)；蟬總科雌成蟲雌性附腺著生于側(cè)輸卵管基部，受精囊附腺極長(鐘海英, 2014)；角蟬總科雌成蟲雌性附腺2根，粗長，受精囊附腺1根，基半部細(xì)于端半部(Tsai and Perrier, 1996; 鐘海英, 2014)。本研究中斑衣蠟蟬受精囊附腺為2根螺旋管，連接在受精囊末端，附著在交配囊上，雌性附腺結(jié)構(gòu)退化，這與蠟蟬總科中穎蠟蟬科(Achilidae)、蠟蟬科(Fulgoridae)、廣蠟蟬科(Ricaniidae)、蛾蠟蟬科(Flatidae)及象蠟蟬科(Dictyopharidae)雌成蟲雌性附腺和受精囊附腺的結(jié)構(gòu)組成(Bourgoin, 1993; Bourgoin and O′Brien, 1994; D′Ursoetal., 2005; 林江, 2011)一致。可見頭喙亞目中不同總科雌成蟲雌性附腺與受精囊附腺的形態(tài)特征存在明顯區(qū)別。這些形態(tài)特征差異是否可以作為該亞目高級階元劃分的依據(jù)，仍有待進(jìn)一步探討。

在雌性生殖系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)方面，本研究觀察的斑衣蠟蟬中輸卵管由中輸卵管腔、上皮細(xì)胞、肌肉鞘和基膜組成，且肌肉層發(fā)達(dá)，這與葉蟬總科中黑尾葉蟬Bothrogoniaferruginea、玻璃葉蟬Homalodiscacoagulata、橫線葉蟬Exitianusnanus、條沙葉蟬Psammotettixstriatus和槭錐頂葉蟬Japananushyalinus中輸卵管的超微結(jié)構(gòu)(Hayashi and Kamimura, 2002; Hummeletal., 2006; 蘇梅, 2014)大體一致，但斑衣蠟蟬中輸卵管上皮細(xì)胞層內(nèi)未發(fā)現(xiàn)微絨毛和分泌顆粒；此外，斑衣蠟蟬交配囊囊壁由上皮細(xì)胞、肌肉層和基膜組成，上皮細(xì)胞層內(nèi)有囊泡和基膜內(nèi)折，這與沫蟬總科中牧草長沫蟬Philaenusspumarius、陜西尖胸沫蟬Aphrophorashaanxiensis和四斑象沫蟬Philagraquadrimaculata交配囊結(jié)構(gòu)(王婷婷, 2015)相似，但上皮細(xì)胞層中未發(fā)現(xiàn)黑色顆粒物。斑衣蠟蟬與其他頭喙亞目昆蟲雌性生殖系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)是否還存在更多差異，也需要進(jìn)一步深入研究。