蘇麗娟, 肖元璽, 李 琰, 伍志偉, 趙鵬飛, 楚君鵬,魏紀(jì)珍, 安世恒, 尹新明, 宋安東,*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450002; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 鄭州 450002)

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富和最廣泛的生物能源，其結(jié)構(gòu)組分包括β鏈接的聚合纖維素(β-linked polymeric cellulose)、半纖維素、酚醛聚合物木質(zhì)素和其他一些小分子組件(Ragauskasetal., 2005; Sethietal., 2013)。這些組分通過半纖維素的分子黏合，作為支撐骨架包圍并加固著纖維素和半纖維素，木質(zhì)纖維素的這種復(fù)雜、致密的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其木質(zhì)纖維素解聚效率低(Ragauskasetal., 2006; Lange, 2007; Anderson and Akin, 2008; Yang and Wyman, 2008)。由于白蟻可以消化攝入植物材料中高達99%的纖維素，白蟻和其腸道微生物是木質(zhì)纖維素降解酶的寶貴資源，白蟻在消化木質(zhì)纖維素方面受到越來越多的關(guān)注(Ohkuma, 2003; Scharf and Tartar, 2008; Scharf and Boucias, 2010; Ni and Tokuda, 2013; 曹慧芳, 2018; 杜嬌等, 2019)。迄今為止，文獻報道有110多種經(jīng)過PCR擴增再經(jīng)過異源重組表達的白蟻或共生的消化酶，這些酶來自于13種白蟻，主要有黃胸散白蟻Reticulitermessperatus(24%)、臺灣乳白蟻Coptotermesformosanus(17%)、北美散白蟻Reticulitermesflavipes(15%)、中脈象白蟻Nasutitermescostalis(11%)、高山象白蟻Nasutitermestakasagoensis(9%)、恒春新白蟻Neotermeskoshunensis(6%)和黃翅大白蟻Macrotermesbarneyi(2%)等(杜嬌等, 2019; 馬玉俊等, 2019)；這些重組消化酶中60%來源于細菌，29%來源于宿主白蟻，11%來源于共生原生物；這些酶的不同重組表達平臺已經(jīng)應(yīng)用，其中細菌和酵母應(yīng)用最多(分別為47%和34%)，其次是桿狀病毒/昆蟲(11%)和真菌(8%)的表達系統(tǒng)。這110多種酶中，95%為糖基水解酶(glycosyl hydrolase, GH)，3%是酚氧化酶/木質(zhì)素酶，2%是酯酶。GH家族有幾個關(guān)鍵家族組成，主要包括42% GHF9(內(nèi)切葡聚糖酶)，28% GHF5(纖維素酶)，11% GHF7(內(nèi)切葡聚糖酶/外切纖維素酶)，9% GHF45(半纖維素酶)，6% GHF1(β-葡糖苷酶)，2% GHF11(半纖維素酶)和1% GHF8和GHF10(纖維素酶)(Scharf, 2015)。

白蟻的消化道可分為前腸(foregut)、中腸(midgut)和后腸(hindgut)3部分。前腸包括嗉囊(crop)和肌胃(gizzard)，對白蟻取食的木塊進行機械研磨；中腸是主要的消化酶分布和營養(yǎng)物質(zhì)吸收場所；后腸是整個消化道最大的部分，為眾多的腸道共生微生物提供生存環(huán)境，這些共生微生物包括細菌、古細菌和原生生物(Ni and Tokuda, 2013)。研究者普遍認(rèn)為白蟻的木質(zhì)纖維素降解體系由白蟻自身產(chǎn)生的纖維素酶與腸道共生微生物群(包括腸道共生原生動物和共生細菌)產(chǎn)生的酶系共同組成(Scharfetal., 2011; Scharf, 2015)。通過對白蟻纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶的來源分析，可以推測出白蟻在攝食木材后，前腸在研磨食物時將纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase, EG)和β-葡糖苷酶(β-glucosidase, BG)與食物混合，EG水解非結(jié)晶區(qū)的纖維素，BG從末端水解出葡萄糖，酶解作用主要在中腸進行；進入后腸后，低等白蟻的共生原生生物產(chǎn)生的GH5, GH7和GH45家族的EG酶、GH3家族的BG酶作用于結(jié)晶區(qū)的纖維素，高等白蟻則由后腸的共生原核生物產(chǎn)生的酶作用于結(jié)晶區(qū)的纖維素(Ni and Tokuda, 2013)；半纖維素的降解則可能主要依靠共生菌群產(chǎn)生的半纖維素酶；對于木質(zhì)素，白蟻幾乎不能降解，大部分以糞便的方式排出體外(Geibetal., 2008; Brune, 2014)。

上述對白蟻木質(zhì)纖維素酶的研究和開發(fā)在一定程度上豐富了工業(yè)中降解木質(zhì)纖維素的混合酶資源的認(rèn)識，但是目前能夠投入生產(chǎn)應(yīng)用的還遠遠不夠，需要進一步研究和開發(fā)利用新的天然纖維素酶，因此，本研究根據(jù)前期蛋白組測序的結(jié)果，利用PCR結(jié)合RACE克隆了近暗散白蟻Reticulitermesperilucifugus的β-葡糖苷酶7(β-glucosidase 7)基因RpBg7，通過生物信息學(xué)軟件分析了近暗散白蟻RpBg7序列，并對該基因進行了畢赤酵母Pichiapastoris表達，測定表達的β-葡糖苷酶7的酶活性，為豐富纖維素酶資源，構(gòu)建新型、高效的木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化技術(shù)體系提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 近暗散白蟻采集與鑒定

本研究所用的近暗散白蟻，采自河南省信陽市商城縣金剛臺(31°48′N, 115°2′E)。近暗散白蟻一般生活在未經(jīng)開發(fā)的山林中，以枯木為食，采集白蟻時連同枯木一同帶回，放入塑料箱內(nèi)，置于陰暗處，保持溫度20～35℃、相對濕度50%～70%。通過白蟻群體中兵蟻的外部形態(tài)特征(黃復(fù)生等, 2000)以及基于白蟻的線粒體16S rDNA和COII基因(NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列號分別為KX129973和KX290714)的分子鑒定結(jié)合來保證白蟻物種鑒定的準(zhǔn)確和嚴(yán)謹(jǐn)。

1.2 近暗散白蟻β-葡糖苷酶基因的部分序列擴增

從采回的枯木中挑選成年工蟻置于干凈平板內(nèi)，平板置于冰上。按住白蟻頭部，用解剖針從尾部輕輕將白蟻腸道拉出，解剖約100頭后浸于Trizol試劑中，按Invitrogen的操作說明提取樣品總RNA。參考One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Kit(北京全式金生物科技有限公司)合成總cDNA；根據(jù)SMARTer? RACE 5′/3′Kit(TaKaRa Clontech, 日本)說明書合成5′RACE和3′RACE cDNA。

根據(jù)前期等重標(biāo)簽標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)蛋白組測序的結(jié)果(未發(fā)表)，設(shè)計近暗散白蟻腸道內(nèi)的β-葡糖苷酶7基因的引物，F(xiàn): 5′-CATTGGGATCTGCCACAGCCT CTAC-3′；R: 5′-GTTGTCAATTAGAGTCCACGCCG-3′。使用TransStart FastPfu DNA Polymerase(北京全式金生物科技有限公司)進行PCR擴增，反應(yīng)體系: cDNA 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 5×TransStart FastPfu緩沖液10 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶1 μL, 無菌水補足50 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性20 s, 55℃ 20 s, 72℃延伸1 min，循環(huán)35次; 72℃保溫10 min。電泳檢測后將之轉(zhuǎn)入到pEASY-Blunt Simple克隆載體(北京全式金生物科技有限公司)，轉(zhuǎn)化篩選并提取質(zhì)粒測序，得到部分序列。

1.3 RACE擴增近暗散白蟻β-葡糖苷酶基因的全長

由于用反轉(zhuǎn)錄擴增的蛋白序列不完整，僅有部分序列，因此使用5′RACE和3′RACE技術(shù)來獲得該基因的全長序列。根據(jù)1.2節(jié)中得到的β-葡糖苷酶7基因的部分序列，設(shè)計該基因的5′RACE和3′RACE特異性引物。5′RACE引物序列: 5′-GCTAGAACAGGATTGGTCCATCCACC-3′; 3′RACE引物序列: 5′-CATTGGGATCTGCCACAGCCTCTAC-3′。以1.2節(jié)合成的近暗散白蟻腸道內(nèi)容物RACE cDNA為模板，擴增其5′端序列和3′端序列。

5′RACE的反應(yīng)體系(25 μL): 1.2節(jié)中制備的5′RACE cDNA 1 μL, 10×Buffer 2.5 μL, LATaq 0.25 μL, 5′RACE引物(10 mmol/L)0.5 μL, UPM 2.5 μL, 無菌水17.25 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 68℃ 30 s, 72℃延伸3 min, 循環(huán)35次; 72℃保溫10 min。3′RACE的擴增體系、反應(yīng)程序與5′RACE基本相同，僅將模板和引物換為3′RACE cDNA和3′RACE引物。通過瓊脂糖凝膠(1.2%)電泳(DYY-6C瓊脂糖水平電泳儀，北京六一儀器廠)檢測PCR產(chǎn)物，切割目的條帶，送上海生物工程有限公司進行序列測定。測序成功后拼接序列，設(shè)計特異性引物BG-ORF-F: 5′-ATGG GGAGTGATAATTGGGCCACAGA-3′和BG-ORF-R: 5′-CTAAGAACTCTCGACACCCAGAAATTC-3′。以近暗散白蟻腸道內(nèi)容物cDNA為模板，擴增其開放閱讀框，PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2節(jié)。反應(yīng)結(jié)束后，如上述方法檢測并送測。

1.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用Blast工具在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp同源序列分析，選取同源性較高的不同昆蟲的β-葡糖苷酶，以黃粉蟲Tenebriomolitor為外群，用MEGA 7(7.0.14)軟件，選擇Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，用最大似然法(maximum likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行聚類分析。在Swiss-Model網(wǎng)站(網(wǎng)址: https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測各個基因的3D模型；利用pyMOL(http:∥www.pymol.org)對蛋白進行單體的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測；在Expasy網(wǎng)站(molecular weight)和等電點(isoelectric point)(網(wǎng)址: http:∥web.expasy.org/compute_pi/)計算蛋白的分子量；用SignalP 4.1 Server(網(wǎng)址: http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白質(zhì)的信號肽。

1.5 表達載體構(gòu)建及畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化

用pPICZαA胞外表達載體(Invitrogen，美國)，去掉信號肽和終止密碼子，設(shè)計引物引入XhoⅠ和NotⅠ兩個酶切位點，BG-P-F: 5′-CCGctcgagAAAA GAGCTTGGAACGAAGATGGTAAGGGCG-3′; BG-P-R: 5′-AAAAGGAAAAgcggccgcAGAACTCTCGACACC CAGAAATTCTACAGG-3′(小寫字母為酶切位點)。PCR體系與程序同1.2節(jié)。空pPICZαA載體和回收后的RpBg7擴增片段用XhoⅠ和NotⅠ限制性消化酶(江蘇愚公生命科技有限公司)進行雙酶切，酶切體系:XhoⅠ 1 μL,NotⅠ 1 μL, 質(zhì)粒DNA 1 μg/DNA片段200 ng，高純水補足 20 μL。37℃水浴30 min，酶切后進行電泳和回收。用 T4 DNA 連接酶(NEB，美國)連接目的基因與空載體，連接體系: T4 DNA連接酶1 μL，用無菌水補足20 μL，37℃連接 30 min。連接體系轉(zhuǎn)化入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞中，挑選PCR結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并用雙酶切驗證，體系及條件同上。用StuⅠ(江蘇愚公生命科技有限公司)線性化酶切處理融合質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)條件：電壓1.5 kV，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊時間5 ms。然后將轉(zhuǎn)化后的液體涂布在博來霉素濃度為500 μg/mL的YPDS(酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%和1 mol/L山梨醇)平板，挑選長勢較好的單克隆進行驗證。用酵母基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA(提取步驟詳見說明書)。用5AOXI引物(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)與基因下游引物BG-P-R進行PCR驗證，反應(yīng)體系: 酵母基因組DNA 50 ng, 2×Taq Mix 10 μL, 5AOX I(10 μmol/L)0.4 μL, BG-P-R(10 μmol/L)0.4 μL, 無菌水補足20 μL。反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 55℃ 30 s, 72℃延伸1 min, 循環(huán)32次；72℃保溫10 min。

1.6 近暗散白蟻β-葡糖苷酶在畢赤酵母中的表達及檢測

為了誘導(dǎo)表達β-葡糖苷酶表達，用博來霉素濃度為100 μg/mL的50 mL BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)1.5節(jié)獲得的陽性轉(zhuǎn)化子(為確保溶氧量，培養(yǎng)基體積最好不超過容器容積的10%)，30℃過夜培養(yǎng)16～18 h。室溫1 500 g離心5 min收集菌體。用博來霉素濃度為100 μg/mL的50 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，30℃培養(yǎng)。每24 h取樣并補加甲醇至終濃度為1%誘導(dǎo)近暗散白蟻β-葡糖苷酶的表達，7 d后得到誘導(dǎo)表達菌液。對轉(zhuǎn)化入空pPICZαA的X-33畢赤酵母進行同樣的培養(yǎng)，作為后續(xù)實驗的陰性對照。誘導(dǎo)表達菌液胞外分泌蛋白(extracellular secretion proteins)粗酶液的提取方法是，取50 mL的誘導(dǎo)菌液，4℃ 5 000 r/min離心5 min，分離上清和菌體沉淀。上清中分次加入固體硫酸銨，一邊攪拌一邊加入，直至硫酸銨達到飽和。4℃ 12 000 g離心10 min，取沉淀用10 mL 0.1 mol/L PBS溶解，用0.1 mol/L PBS進行透析，透析2次，每次3 h；透析后用PEG 20000濃縮至5 mL，即得到誘導(dǎo)表達菌液的胞外分泌蛋白粗酶液。菌體胞內(nèi)蛋白(extracellular proteins)的提取方法為，用10 mL無菌水徹底懸浮菌體，吸取菌液，4℃ 5 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)3次；向離心管中加入650 μL山梨醇Buffer，再加入50 U酵母細胞破壁酶，30℃水浴1 h，室溫4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集沉淀，加入1 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.4)清洗菌體沉淀，重復(fù)3次，再加入0.8 mL 0.1 mol/L PBS(pH 7.4)收集沉淀，使用超聲波細胞破碎儀破碎菌體，參數(shù)為功率35%，工作3 s，間歇3 s，破碎3 min，4℃ 10 000 r/min離心10 min，上清稀釋至5 mL，即得到胞內(nèi)蛋白粗酶液。

用10% SDS-PAGE電泳檢測胞外分泌蛋白粗酶液和胞內(nèi)蛋白粗酶液中目的蛋白的表達情況，并用4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl β-d-glucopyranoside, 4pNPG)作為底物測定β-葡糖苷酶7的粗酶活性，同樣條件培養(yǎng)的空pPICZαA-X33畢赤酵母的胞外分泌蛋白粗酶液或胞內(nèi)蛋白粗酶液作為陰性對照。粗酶活性測定體系總體積為200 μL，胞外分泌蛋白粗酶液或胞內(nèi)蛋白粗酶液50 μL，50 μL底物，100 μL pH 4.8醋酸鈉緩沖液，于50℃水浴反應(yīng)10 min后加入3 mL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在408 nm處測量吸光度A，根據(jù)公式A=εbc(A為反應(yīng)體系在408 nm處測量吸光度，pNP的消光系數(shù)ε=1.74×10-4/mol·cm·mL，b為比色皿厚度，c為pNP的濃度)計算產(chǎn)物pNP的濃度，從而得到葡萄糖的濃度。酶活性測定重復(fù)3次。酶活力單位(U)定義為1 min內(nèi)生成1 μmol底物所需的酶量為一個酶活力單位。

2 結(jié)果

2.1 近暗散白蟻β-葡糖苷酶基因序列及結(jié)構(gòu)預(yù)測

PCR結(jié)合RACE克隆獲得了近暗散白蟻的一個內(nèi)源性β-葡糖苷酶7基因序列(GenBank登錄號: MN944395)，開放閱讀框長1 485 bp，編碼495個氨基酸殘基，經(jīng)Swiss-Model建模其3D結(jié)構(gòu)，該基因編碼的蛋白是一個(α/β)8-TIM桶裝結(jié)構(gòu)，在催化活性口袋內(nèi)具有保守的堿性氨基酸殘基Glu187和Glu394，這些是糖苷水解酶1(glycoside hydrolase 1, GH1)家族β-葡糖苷酶的典型特征，因此認(rèn)為其屬于GH1家族，將該基因命名為RpBg7。在Expasy網(wǎng)站預(yù)測RpBg7的分子量是57 kD，等電點5.51，不穩(wěn)定系數(shù)為38.4，SignalP 4.1 Server分析RpBg7的信號肽位于第1-42位氨基酸。

使用Phyre2分析了蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白包含了19個α螺旋和14個β折疊。通過單體的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測并與恒春新白蟻的β-葡糖苷酶NkBg(GenBank登錄號: AB073638.2)進行了結(jié)構(gòu)對比，發(fā)現(xiàn)兩者的3D結(jié)構(gòu)完全重合，均含有GHF1 β-葡糖苷酶的典型(a/b)8-TIM桶形褶皺。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp同源序列分析，近暗散白蟻的內(nèi)源性RpBg7的氨基酸序列與其他18種昆蟲的序列同源性較高，其中RpBg7的氨基酸序列與棲北散白蟻Reticulitermessperatus的β-葡糖苷酶(GenBank登錄號: AB915866.1)序列一致性最高(88.33%)。其次是與臺灣乳白蟻(GenBank登錄號：JN565079.1, 86.46%)、黑翅土白蟻Odontotermesformosanus(GenBank登錄號：GU591172.1, 82.55%)和土垅鋸白蟻Microcerotermesannandalei(GenBank登錄號：KU170546.1, 81.66%)，與其余的物種同源蛋白氨基酸序列一致性均在60%以下(圖1)。結(jié)合序列比對的情況，我們推測第187和394位的谷氨酸(E)為其催化殘基(圖1中紅色五角星號標(biāo)注)，催化酸/堿的TXNEP基序(X是疏水性氨基酸殘基)位于β折疊6的末端，催化的親核體I/VTENG基序位于β折疊11的末端，這也是典型的GHF1家族的特征；第39位的谷氨酰胺(Q)、第142位的組氨酸(H)、第143, 436和444位的色氨酸(W)、第186和441位的天冬氨酸(N)、第330位的蘇氨酸(T)、第443和450位的谷氨酸(E)和第452位的苯丙氨酸(F)為糖苷的糖基結(jié)合囊(glycone-binding pockets)的殘基(圖1中綠色倒三角標(biāo)注)；第190和247位的纈氨酸(V)、第249位的精氨酸(R)、第331位的酪氨酸(Y)、第332位的丙氨酸(A)和第366位的色氨酸(W)為糖基配基結(jié)合囊(aglycone-binding pockets)的殘基(圖1中藍色圓點標(biāo)注)。

圖1 近暗散白蟻與其他昆蟲β-葡糖苷酶氨基酸的序列比對

2.2 近暗散白蟻β-葡糖苷酶基因RpBg7的系統(tǒng)進化位置

利用MEGA 7(7.0.14)軟件，采用最大似然法進一步分析了近暗散白蟻β-葡糖苷酶基因RpBg7的進化位置。我們以黃粉蟲Tenebriomolitor為外群，將近暗散白蟻RpBg7氨基酸序列與18種昆蟲的相近基因進行了進化樹分析結(jié)果表明(圖2)。結(jié)果表明，近暗散白蟻RpBg7與棲北散白蟻的β-葡糖苷酶的進化關(guān)系最近，其次是與臺灣乳白蟻。但是同為散白蟻屬的美洲散白蟻Reticulitermesflavipes卻與近暗散白蟻關(guān)系較遠，與格斯特乳白蟻Coptotermesgestroi和黃翅大白蟻Macrotermesbarneyi進化關(guān)系比較近(圖2)。這與上述氨基酸序列分析同源性較高結(jié)果一致。

圖2 最大似然法構(gòu)建的基于昆蟲β-葡糖苷酶氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 近暗散白蟻β-葡糖苷酶RpBg7在畢赤酵母中表達及酶活性

從克隆載體pPICZαA上PCR擴增引入酶切位點的目的基因(圖3)，從圖中可以看出擴增效果較好，無非特異性條帶，可以切膠回收。構(gòu)建的RpBg7-pPICZαA重組質(zhì)粒雙酶切驗證(圖3)顯示載體已成功構(gòu)建，經(jīng)過測序顯示無突變、移碼和堿基增減等情況，確定連接成功，可以向畢赤酵母中轉(zhuǎn)化。從圖3可以看出融合表達質(zhì)粒均被StuⅠ完全切開，濃縮之后使用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達。

圖3 畢赤酵母表達載體RpBg7-pPICZαA驗證

使用10% SDS-PAGE電泳檢測胞外分泌蛋白粗酶液和胞內(nèi)蛋白粗酶液目的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)蛋白粗酶液在57 kD處有清楚的目的蛋白條帶(圖4，紅色箭頭所示)，而胞外分泌蛋白粗酶液未檢測到目的條帶(文中未顯示)。用pPNG檢測RpBg7在胞外分泌蛋白粗酶液和胞內(nèi)蛋白粗酶液的酶活性，均可以檢測到酶活性。發(fā)現(xiàn)RpBg7在胞外分泌蛋白粗酶液中的酶活性為4.43 U，在胞內(nèi)蛋白粗酶液中的酶活性為7.47 U。

圖4 RpBg7在畢赤酵母X-33中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

3 討論

Cazy數(shù)據(jù)庫(http:∥www.cazy.org)將目前發(fā)現(xiàn)的β-葡糖苷酶依據(jù)序列的一致性分成GH1, GH3, GH5, GH9, GH30和GH116共6個家族當(dāng)中，目前發(fā)現(xiàn)的β-葡糖苷酶多屬于GH1和GH3家族。β-葡糖苷酶GH1, GH5和GH30家族屬于Clan A超家族，酶結(jié)構(gòu)呈保守的(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，催化通道呈口袋狀。本實驗克隆并表達了近暗散白蟻的內(nèi)源性β-葡糖苷酶7基因RpBg7，通過其基因序列的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該β-葡糖苷酶是典型的GH1家族基因，具有GH1 β-葡糖苷酶典型的(a/b)8-TIM桶形褶皺，即口袋狀，GH1催化活性位點包含兩個保守的Glu，靠近N端的Glu位于第4個β折疊片上，在催化反應(yīng)時提供親核基團，靠近C端的Glu位于第7個β折疊片上，在催化反應(yīng)時提供質(zhì)子(曹慧芳, 2018)。因此推測，近暗散白蟻β-葡糖苷酶RpBg7的催化位點是Glu187和Glu394，也具有典型的糖苷的糖基結(jié)合囊的殘基和糖基配基結(jié)合囊的殘基。而β-葡糖苷酶作用于纖維二糖在內(nèi)的纖維寡糖，從非還原端切割產(chǎn)生單個的葡萄糖(Lyndetal., 2002; Liaoetal., 2011)，在纖維素酶的協(xié)同作用過程中，纖維二糖的堆積常常會反饋抑制EG和CBH的酶活性從而影響整個酶系的水解效率(Holtzappleetal., 1990)，所以β-葡糖苷酶是纖維素分解為二糖、再分解為單糖的酶解體系的關(guān)鍵限速酶。

雖然在碳水化合物活性酶(CAZy)數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可以找到很多的β-葡糖苷酶，但是酶活性高、熱穩(wěn)定性好和葡萄糖耐受性強的卻很少(Cantareletal., 2009; Cairns and Esen, 2010)。迄今為止，也有多種白蟻的內(nèi)源性纖維素酶被表達，原始單酶活性均不高，比如黃翅大白蟻 β-1,4內(nèi)切葡聚糖酶的酶活性為14.1 U/mL(杜嬌等, 2019)，在枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis中表達的黃翅大白蟻β-葡糖苷酶活性為0.21 U/mL；另外也有白蟻內(nèi)生菌的分離，包括堅強芽孢桿菌Bacillusfirms的纖維素內(nèi)切酶(CMCase)活性是95 U/mL(馬玉俊等, 2019)，黑胸散白蟻Reticulitermeschinensis腸道內(nèi)共生枯草芽胞桿菌的β-1,4內(nèi)切葡聚糖酶活性為4.57 U/mL(王智偉等, 2018)。本研究克隆表達的β-葡糖苷酶7在畢赤酵母中表達的酶活性為7.47 U/mL(圖4)，作為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的工業(yè)應(yīng)用還遠遠不夠，但是它是來源于天然生物材料的纖維素酶，可以與其他的天然生物系統(tǒng)中的纖維素酶高度協(xié)同作用于天然底物，另外也應(yīng)該具有天然酶的酶學(xué)性質(zhì)，比如溫度、pH值，尤其是對高糖底物的耐受性，都需要進一步研究以適應(yīng)工業(yè)需要。

相對于白蟻的防御、生物材料、工程和進化方面的研究，目前人們理解最多的是白蟻的木質(zhì)纖維素降解，包括白蟻的消化和腸道共生物的互作，及一些新的重組木質(zhì)纖維素酶的重要應(yīng)用。下一步對白蟻研究的焦點將集中在如下方面：一是白蟻自身消化的生物質(zhì)預(yù)處理的進一步探索；二是預(yù)處理酶的開發(fā)，這些酶是針對于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的非纖維素成分(例如木質(zhì)素和其他酚類成分)，同時也包括混合酶的應(yīng)用；三是在生物反應(yīng)器中保護微生物和酶的抗氧化劑和解毒酶；最后是關(guān)于生物質(zhì)消化的研究，最大的需求還是重組酶的應(yīng)用策略，這包括淡化合成底物，而強調(diào)實際的木質(zhì)纖維素物料，而且用更多測量底物消化的定量方法(Scharf, 2015)。