崔 黎，崔 瑩，趙 娜，陳奎生

(1．鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052；2.鄭州衛(wèi)生健康職業(yè)學院病理教研室，河南 鄭州 450199；3.鄭州市中心醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450007)

世界范圍內(nèi)腫瘤死亡原因中，肺癌居首位，每年有180萬新發(fā)病例，其中有80%～85%屬于非小細胞肺癌(non small cell lung adenocarcinoma，NSCLC)。在我國，NSCLC的發(fā)病率也呈逐年升高。肺腺癌是NSCLC的一種，其發(fā)生率約占所有肺癌的50%，是肺腫瘤中最常見的組織學類型[1]。目前，化療、靶向治療是治療中晚期肺腺癌的重要治療辦法，診療中發(fā)現(xiàn)眾多中晚期患者化療療效不理想，關鍵驅(qū)動基因(如表皮生長因子受體、KRAS、MET)的突變是主要原因。KRAS是NSCLC患者常見的突變致癌基因[2]，伴有KRAS基因突變的肺腺癌，其復發(fā)、轉(zhuǎn)移風險更高[3]。突變的KRAS基因會降低三磷酸鳥苷 (guanosinetriphosphate，GTP)酶的活性，保持和GTP結(jié)合狀態(tài)，使下游信號通路保持激活狀態(tài),持續(xù)并無限制地向細胞發(fā)送信號，這些信號不符合細胞自然的生長特性，可刺激細胞持續(xù)生長，減少細胞死亡，進而導致腫瘤的發(fā)生。DEAD盒多肽43(DEAD box polypeptide 43，DDX43)是一種腫瘤特異性基因，在人橫紋肌肉瘤LB23-SAR細胞株中最早被鑒定。DDX43基因由648個氨基酸組成，位于染色體6q12～13，全長2 300 bp，主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)[4]。DDX43基因與腫瘤細胞的惡性增殖、化療藥物耐藥、腫瘤免疫有著重要的相關性。多種實體腫瘤中均可見DDX43的高水平表達[5]。KRAS信號轉(zhuǎn)導通路中DDX43起到調(diào)節(jié)作用，促進腫瘤細胞的增殖、惡性轉(zhuǎn)化，并在增強腫瘤侵襲、腫瘤免疫及耐藥等方面都能起到關鍵作用。本研究應用免疫組化、熒光原位雜交技術(shù)，觀察正常肺組織、肺泡上皮非典型腺瘤樣增生、肺腺癌組織中DDX43蛋白、mRNA的表達情況，對其結(jié)果進行分析，探討肺腺癌組織中DDX43蛋白和mRNA表達與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關系，為伴有KRAS基因突變肺腺癌患者的治療，尋找理想靶點，提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本來源62例肺腺癌標本、31例肺泡上皮非典型腺瘤樣增生標本均收集于2015年1月至2017年9月鄭州大學第一附屬醫(yī)院的手術(shù)標本，正常肺組織取自肺腺癌患者手術(shù)切緣處。術(shù)前，所有患者均經(jīng)穿刺活檢明確診斷。離體0.5～1 h分離出正常肺組織、腺癌組織、肺泡上皮非典型腺瘤樣增生組織；固定于中性多聚甲醛液體中，用于后續(xù)HE染色、免疫組化及熒光原位雜交的實驗。

1.2 患者臨床病理資料62例肺腺癌患者：男36例，女26例；年齡≥60歲33例，<60歲29例； 52例混合型，4例腺泡型，3例實體型，3例乳頭型；20例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，42例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；55例有胸膜侵犯，7例無胸膜侵犯；有脈管侵犯47例，無脈管侵犯15例。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化 嚴格參照免疫組化試劑盒說明書進行操作。以濃度為1∶100的一抗(兔抗人DDX43多克隆抗體)滴加入切片。陽性對照：用DDX43陽性表達的食管鱗癌組織代替，結(jié)果陽性；陰性對照：用正常羊血清代替一抗，結(jié)果陰性；空白對照：以PBS代替一抗，結(jié)果陰性。

1.3.2 熒光原位雜交 探針由上海生物有限公司合成；陰性對照：選用無探針的雜交液孵育組織切片，結(jié)果陰性；陽性對照：用DDX43 mRNA陽性表達的食管鱗癌組織代替，結(jié)果陽性。

1.4 觀察指標

1.4.1 DDX43蛋白 陽性信號顯色呈現(xiàn)淺黃至深黃色顆粒，主要定位于細胞質(zhì)。參照文獻[6]，采用雙盲法，觀察10個視野/每張切片(×200)，根據(jù)染色強度和染色數(shù)量，記錄平均數(shù)。

1.4.2 DDX43 mRNA 陽性表達顯色呈現(xiàn)綠色熒光信號標記，主要位于細胞質(zhì)。參照文獻[7]，制定熒光原位雜交判讀方法：每張切片隨機選取200個細胞進行計數(shù)，重疊的細胞不參與計數(shù)，計算陽性細胞數(shù)和陽性細胞率。

2 結(jié)果

2.1 不同肺組織中DDX43蛋白表達的比較正常肺組織、肺泡上皮非典型腺瘤樣增生、肺腺癌組織中DDX43蛋白的陽性表達率分別為0.00%、38.71%、88.71%，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=63.150，P<0.001)；三者兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表1、圖1。

表1 不同肺組織中DDX43蛋白表達的比較

圖1 不同肺組織中DDX43蛋白免疫組化染色圖片比較(IHC，×200)

2.2 不同肺組織中DDX43 mRNA表達的比較正常肺組織、肺泡上皮非典型腺瘤樣增生、肺腺癌組織中DDX43 mRNA的陽性表達率分別為8.06%、38.71%、82.26%，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=53.124，P<0.001)；三者兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2、圖2。

表2 不同肺組織中DDX43 mRNA表達的比較

圖2 不同肺組織中DDX43 mRNA表達的熒光原位雜交檢測情況比較(×200)

2.3 肺腺癌組織中DDX43蛋白和mRNA表達與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關系肺腺癌組織中DDX43蛋白和mRNA的表達均與其有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵犯、脈管侵犯有關(蛋白：χ2=3.214，P=0.040；χ2=14.230，P=0.001；χ2=10.400，P=0.001；mRNA：χ2=4.590，P=0.030；χ2=6.223，P=0.008；χ2=10.400，P=0.001)。見表3。

3 討論

DDX43屬于DEAD盒家族成員，是三磷酸腺苷依賴性RNA解螺旋酶，又被稱為解旋酶抗原[8]。DDX43基因位于人第6號染色體，編碼一個由648個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，全長2 300 bp，主要定位于細胞質(zhì)中。雖然目前DDX43的生理功能還沒有完全明確，但作為RNA解螺旋酶，在RNA代謝的諸多環(huán)節(jié)都可發(fā)揮作用，是RNA代謝過程中不可或缺的驅(qū)動力，對于多種腫瘤細胞的生長、增殖都發(fā)揮非常重要的作用。

相較于肺癌的其他組織學類型，腺癌的驅(qū)動基因更為明確[9]。80%以上的肺腺癌有明確的驅(qū)動基因，KRAS作為肺腺癌的驅(qū)動基因之一，可催化其下游效應底物，對細胞生長、分化、凋亡等環(huán)節(jié)起到調(diào)節(jié)作用。人體正常生理細胞增殖與KRAS蛋白相關，KRAS蛋白可使細胞增殖失控，從而導致腫瘤細胞形成。研究[10]揭示，突變KRAS基因可作為NSCLC生存的不利影響因素。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，突變KRAS基因發(fā)揮著關鍵作用[11]，RAS/RAF/MEK/MAPK通路在肺癌信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)中起核心作用，其中以KRAS突變最常見[12]。

表3 肺腺癌組織中DDX43蛋白和mRNA表達與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關系

DDX43作為一種免疫原性腫瘤相關抗原，對腫瘤的增殖不可或缺，在很多腫瘤中過度表達[13]。DDX43表達與腫瘤的惡性增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤細胞的耐藥有關。DDX43在腫瘤組織中表達下調(diào)，引起KRAS通路中NRAS蛋白的表達明顯下降，同時降低了轉(zhuǎn)導通路下游的ERK信號通路，因此導致降低AKT的活性[14]。

本研究表明，DDX43蛋白和mRNA在伴有KRAS基因突變的肺腺癌組織中高表達，肺腺癌的臨床病理參數(shù)與DDX43蛋白和mRNA的表達有明顯的相關性[15]。這一研究有助于KRAS基因突變肺腺癌患者的治療尋找理性靶點，也為臨床治療肺腺癌奠定了理論基礎。