吳 愷，何宏博，張 澎，曾 誠，劉東雷，趙 松

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

食管癌作為中國最常見的、最具侵襲性的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病率、致死率高、預后差等特點[1]。據世界癌癥報告統(tǒng)計，食管鱗狀細胞癌為食管癌的主要病理類型[2]。此外，食管癌的耐藥、轉移和復發(fā)等均嚴重限制了患者的化療成功率。目前，以順鉑為基礎的化療仍是食管鱗癌患者最為常見的化療方案，但部分食管癌患者連續(xù)治療一段時間后對順鉑的敏感性較差，導致耐藥的產生，引起食管癌的復發(fā)和轉移，嚴重影響患者的治療[3-4]。因此，了解食管鱗癌的耐藥機制，篩選與耐藥相關的新靶點，可顯著提高臨床精準治療，提高患者的合理用藥，改善預后。

微小RNAs(micro RNAs, miR)是一種存在于生物體內的、高度保守的、長度約為21～25 nt的非編碼內源性單鏈小RNA，其可通過與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)域結合降解/抑制靶基因mRNA的表達發(fā)揮轉錄后調節(jié)作用，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及對藥物的敏感性[5-6]。據研究[7]報道，骨肉瘤中miR-454的表達顯著降低，且過表達miR-454可抑制骨肉瘤的生長和侵襲。而miR-454高表達的肝癌患者具有更短的生存期和更差的預后[8]。此外，miR-454在肺癌和結腸癌中可作為一種促癌基因，下調miR-454可降低降低癌細胞的增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡[9-10]。這些研究結果均提示miR-454在不同腫瘤中的功能具有多樣性。但目前有關miR-454在食管鱗癌化療敏感性中的功能及調控機制仍無報道?；诖?，闡明miR-454在順鉑耐藥的食管鱗癌中的生物特性、對順鉑化療敏感性的影響及分子機制，可為其作為靶點應用于食管鱗癌的綜合治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑食管鱗癌細胞EC109購自上海生物科學院細胞庫；順鉑、二甲基亞砜、噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；RPMI-1640、胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIzol試劑及RNA提取試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；miRNeasy?Mini Kit購自德國Qiagen公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)試劑盒均購自美國Thermo公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen 公司；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)γ、AKT、鼠抗人血管內皮生長因子抗體購自美國Abcam公司；鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；miR-454模擬物及其相應的陰性對照mimic miR-454 control均購自上海生工生物工程有限公司；miR-454 inhibitor、內參基因U6購自上海吉瑪有限公司。本實驗中涉及的基因及引物序列見表1。

1.2 細胞系及培養(yǎng)采用體積分數10%胎牛血清、質量分數1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)EC109細胞，在37 ℃恒溫、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數期狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.3 耐藥細胞株的構建及培養(yǎng)采用遞增藥物濃度-間歇沖擊作用的方法構建順鉑食管鱗癌耐藥細胞株EC109/DPP。取狀態(tài)良好并處于對數生長期的EC109細胞，最開始加入順鉑(1 μmol/L)開始培養(yǎng)，24 h后更換全新的新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基，待EC109細胞再次正常生長后再次加入順鉑(1 μmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)EC109細胞。直到EC109細胞穩(wěn)定生長且傳代3次以上，測定IC50。在培養(yǎng)基中反復加入逐漸遞增濃度的順鉑一直到EC109細胞能在Cisplatin(10 μmol/L)的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長且傳代代3 次以上，測定IC50。

1.4 miRNA轉染選取處于對數期且生長良好的EC109/DPP細胞用于后續(xù)實驗。將EC109/DPP細胞進行6孔板鋪板，鋪板的密度為3×105個細胞/孔，鋪板后進行培養(yǎng)，過夜。按照Lipofectamine 2000的說明書，首先調整脂質體與miR的比例，選取細胞生長最好的最佳比例，進行miR轉染。轉染后，將EC109/DPP細胞置于恒溫培養(yǎng)箱中，每4～6 h的培養(yǎng)期間更換新鮮的含血清培養(yǎng)基。轉染實驗設計的基因序列見表1。轉染24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.5 qRT-PCR檢測miR-454表達采用miRNeasy?Mini Kit提取試劑盒提取EC109/DPP細胞的miRNA。分別檢測各組細胞中RNA濃度和純度，逆轉錄RNA，采用U6作為內參(內參引物見表1)。qRT-PCR實驗選用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒，平行實驗每組均重復3次，計算平均Ct值，根據2-ΔΔCt相對定量計算公式計算miR-454在各組細胞中的相對表達水平。

表1 基因及引物序列

1.6 MTT法檢測細胞增殖采用MTT法檢測各種細胞的增殖情況。將各組細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，設置接種的密度約為1×104個細胞/孔(96孔板，每孔100 μL)，將各組細胞接種后置于恒溫箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后將培養(yǎng)基更換為含順鉑培養(yǎng)基，設置順鉑的梯度濃度，使其分別為2、4、8、16、32 μmol/L。同時，根據相同的條件培養(yǎng)空白組、陰性對照組細胞(僅含培養(yǎng)基)。將各組細胞分別培養(yǎng)48 h后進行收集，再加入MTT避光培養(yǎng)，4 h后棄掉培養(yǎng)基加入二甲基亞砜，振蕩、靜置一定時間后，采用酶標儀測定吸光度值(波長為570 nm)。根據每組細胞的吸光度計算存活率(各組重復3次)。

1.7 Western blot法檢測PPARγ、AKT蛋白表達水平消化收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA測定蛋白濃度。以體積分數10%分離膠的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠凝膠法跑電泳，蛋白轉至聚二偏氟乙烯膜，體積分數5%胎牛血清封閉2 h后孵育一抗(1600)、β-actin(13 000)，4 ℃孵育過夜。搖床室溫孵育二抗2 h。將聚二偏氟乙烯膜洗滌3次，每次20 min，加入ECL顯色劑。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，分析各組條帶的相對表達量。

2 結果

2.1 EC109、EC109/DPP細胞耐藥性比較與EC109細胞比較，EC109/DPP細胞在經過不同濃度順鉑處理后，細胞增殖顯著受抑制；EC109、EC109/DPP細胞的IC50值分別為(3.53±0.23)μmol/L和(23.61±1.48)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=23.179，P<0.001)。結果表明，EC109/DPP細胞耐藥株構建成功。見圖1。

圖1 順鉑對EC109、EC109/DPP細胞的增殖抑制效應比較

2.2 EC109、EC109/DPP細胞中miR-454表達水平比較利用qRT-PCR檢測EC109、EC109/DPP細胞中miR-454表達。EC109/DPP細胞中miR-454的相對表達量顯著高于EC109細胞中的相對表達量(t=18.931，P<0.001)。此外,與空白組比較，轉染miR-454抑制劑下調miR-454后EC109/DPP細胞miR-454相對表達量明顯降低(t=3.986，P=0.016)。結果表明miR-454抑制劑可抑制miR-454表達。見圖2。

2.3 下調miR-454增加EC109/DPP細胞對順鉑的敏感性隨加入順鉑濃度的增加，與EC109/DPP細胞比較，順鉑+下調miR-454組顯著增加了EC109/DPP細胞對順鉑的敏感性。IC50值分別為(21.01±1.91)μmol/L和(12.43±2.40)μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.843，P=0.008)。這提示隨加入順鉑濃度的增加，與EC109/DPP細胞比較，順鉑+下調miR-454組顯著增加了EC109/DPP細胞對順鉑的敏感性。見圖3。

2.4 下調miR-454對PPAR-γ和AKT蛋白表達的影響采用Western Blot法檢測轉染前后的EC109/DPP細胞中PPAR-γ和AKT蛋白表達。下調miR-454組的EC109/DPP細胞可顯著上調PPAR-γ，下調AKT蛋白(P均<0.05)。結果提示下調miR-454增加EC109/DPP細胞順鉑敏感性的機制可能與調控PPAR-γ和AKT蛋白有關。見圖4。

圖2 EC109、EC109/DPP細胞中miR-454表達水平比較

A：EC109、EC109/DPP細胞中miR-454表達；B：EC109/DPP細胞中是否轉染miR-454抑制劑后miR-454表達。與EC109細胞比較，1)P<0.05；與空白組比較；2)P<0.05

圖3 下調miR-454對EC109/DPP細胞順鉑敏感性的影響

3 討論

食管鱗癌是最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，為河南省較為特異性高發(fā)的腫瘤。許多患者確診時已為中期或晚期，進展較快，預后極差，嚴重威脅患者的生命健康[2]。以順鉑為基礎的傳統(tǒng)化療方案目前仍為食管癌治療的常規(guī)治療方案，在食管癌患者中廣泛應用。但許多患者在應用此化療方案一段時間后對順鉑產生了耐藥，化療過程中產生的耐藥、轉移和復發(fā)進一步造成食管鱗癌患者的化療失敗和死亡[3]。食管癌的耐藥機制是一個多因素、多機制參與的復雜過程，主要與多藥耐藥轉運蛋白的表達、細胞內生物活性酶活性的改變、p53及微管蛋白改變、熱休克蛋白改變等密切相關[4]。但食管鱗癌耐藥的機制仍未完全闡釋清楚。

近年來，許多研究報道m(xù)iR可與相應靶基因mRNA的非編碼區(qū)域結合，進而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移[5]。miR在許多惡性腫瘤中異常表達，作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、進展及耐藥過程中發(fā)揮著重要的作用。關于miR-454調控惡性腫瘤細胞的生長相關研究受到廣泛關注。miR-454在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。如過表達miR-454可抑制骨肉瘤、肝癌等的生長和侵襲；下調miR-454可降低腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡。但目前仍未有miR-454在食管鱗癌化療敏感性中的作用及機制等相關報道。

本課題組前期基因芯片結果發(fā)現，miR-454在順鉑耐藥的EC109細胞中特異性高表達。結果表明miR-454可能參與EC109/DPP細胞的調控。黃云龍等[11]發(fā)現過表達miR-218有助于增加食管鱗癌細胞對順鉑的敏感性，給對順鉑耐藥的食管鱗癌患者提供潛在的基因治療靶點；而馬鳴等[12]研究發(fā)現miR-429可通過抑制Bmi-1表達提高食管鱗癌細胞的化療敏感性。以上結果說明miR可調控食管鱗癌細胞的化療敏感性。因此，本研究擬進一步探究miR-454在EC109/DPP細胞中的作用及相關機制。

圖4 miR-454對EC109/DPP細胞中PPAR-γ和AKT蛋白表達的影響

本研究采用遞增藥物濃度-間歇沖擊結合的方法誘導EC109/DPP細胞，此方法已被廣泛應用[13-14]，本研究在以上研究的基礎上進一步改進了方法。結果發(fā)現，與EC109細胞比較，EC109/DPP細胞在經過不同濃度順鉑處理后，細胞增殖顯著受到抑制；EC109細胞、EC109/DPP細胞的IC50值分別為(3.49±1.05)μmol/L和(23.18±1.22)μmol/L。結果表明，EC109/DPP細胞耐藥株構建成功。

qRT-PCR結果進一步證實，與EC109細胞比較，EC109/DPP細胞中miR-454的相對表達量顯著升高。EC109/DPP細胞轉染miR-454抑制劑后可顯著下調miR-454的表達。而miR-454可能在EC109/DPP細胞中發(fā)揮一定的作用。本文結果顯示，隨加入順鉑濃度的增加，與EC109/DPP細胞比較，下調miR-454顯著增加了EC109/DPP細胞對順鉑的敏感性。上述結果進一步驗證了miR-454可調控EC109細胞對順鉑的耐藥性。

PPAR-γ作為PPARs家族的一種核轉錄因子，與相應配體結合后可誘導或抑制靶基因的表達[15]。據研究[16]報道，PPAR-γ表達于肺癌、結腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中。高表達PPAR-γ的乳腺癌患者疾病無進展生存期更長[17]。而在非小細胞肺癌細胞系中，PPAR-γ活化可致腫瘤細胞分化并誘導其凋亡[18]。但PPAR-γ在食管癌耐藥中的作用報道極少。根據上述結果我們可推測，PPAR-γ下調可能為腫瘤細胞耐藥的機制之一。本研究結果發(fā)現，與空白組和順鉑組比較，下調miR-454組和順鉑+下調miR-454組的EC109/DPP細胞可顯著上調PPAR-γ。此外，EC109/DPP細胞中AKT的磷酸化水平降低，這說明AKT的活化也參與到食管癌細胞對順鉑的耐藥中，但PPAR-γ如何與AKT相互影響尚不清楚，仍值得深入研究。

綜上所述，本研究首次證實了下調miR-454表達可增強EC109/DPP細胞對順鉑的敏感性，其作用機制可能與上調PPARγ蛋白、下調AKT蛋白表達有關。本研究可為提高食管癌的臨床精準治療奠定一定的理論基礎。