王超,董曉艷,蔣鯤,朱丹穎,方永雙,李孟榮

1上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學附屬兒童醫(yī)院，上海 200062;2 溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，育英兒童醫(yī)院

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童常見的呼吸道慢性疾病之一，嚴重影響兒童的生長發(fā)育及身心健康。哮喘的病因、發(fā)病機制及治療方法一直是臨床研究的熱點。CpG寡核苷酸(CpG oligonucleotides，CpGODN) 是一類含有與微生物體內(nèi)類似的、具有免疫活性的非甲基化GC序列單鏈脫氧寡核苷酸(ssDNA)片段的統(tǒng)稱，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。多項動物實驗[1～3]表明，CpGODN可誘導小鼠Th1型免疫反應，抑制Th2型免疫應答，可以有效地預防和治療哮喘。胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)是一種上皮源性細胞因子，與TSLP受體(TSLPR)結(jié)合而發(fā)揮生物學功能。越來越多的研究[4，5]結(jié)果表明，TSLP可能是啟動哮喘和過敏癥的關鍵因子，并介導過敏進程的發(fā)生、發(fā)展。CpGODN在哮喘中的具體作用機制目前尚不明確。CpGODN是否可以通過干預哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)及血清TSLP的表達變化，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用？為此我們建立急性哮喘小鼠模型，觀察CpGODN腹腔注射的急性哮喘小鼠BALF、血清TSLP的表達變化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑 SPF級健康雄性Balb/c小鼠36只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自中國科學院上海實驗動物中心，于溫州醫(yī)學院實驗動物中心層流實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度70%，晝夜照明12/12h；CpGODN:硫代磷酸化CpGODN1826 (5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)，上海生工生物工程有限公司；卵清白蛋白(OVA)、地塞米松(DXM)購自美國Sigma公司；TSLP酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海朗頓生物科技公司。

1.2 動物分組、哮喘誘發(fā)及CpGODN用法 36只小鼠(4～6周)隨機分為4組，每組各9只。哮喘模型組(A組)、DXM干預組(B組)、CpGODN干預組(C組)用OVA致敏和激發(fā)建立小鼠急性哮喘模型：0.1%OVA/AL(OH)3混合凝膠0.1 mL于第1、14天腹腔注射致敏，第25～31天1%OVA霧化吸入激發(fā)，每日1次,每次30 min，連續(xù)7 d；B組激發(fā)前1 d和每次激發(fā)前1 h，0.5 mg/kg的DXM腹腔注射；C組激發(fā)前1 d和每次激發(fā)前1 h，50 μg的CpGODN腹腔注射。D組為正常對照組，每次致敏和激發(fā)均以生理鹽水代替。在致敏階段，第1次致敏后，各組小鼠表現(xiàn)無明顯差異，在激發(fā)階段，A組小鼠表現(xiàn)為煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐和二便失禁等癥狀，嚴重者呼吸減慢或節(jié)律不齊，動作遲緩或俯伏不動、四肢癱軟，反應遲鈍；B、C組小鼠上述表現(xiàn)較A組明顯減輕；D組小鼠均無上述癥狀。

1.3 各組小鼠肺組織炎癥水平觀察 末次激發(fā)24 h時，取各組小鼠，摘取眼球收集血液，2 000 r/min離心15 min，吸取血清-80 ℃保存。頸椎脫臼處死小鼠，打開胸腔，暴露肺組織，夾閉左肺門處，1 mL PBS緩沖液分3次于氣管插管處注入，緩慢沖洗右肺，回收BALF，回收率約80%，2 000 r/min離心15 min，取上清液-80 ℃保存待檢。左肺組織用4%多聚甲醛固定，制備石蠟包埋切片，蘇木素一伊紅染色用于光鏡觀察；同時取左肺組織，置預冷的2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸固定，常規(guī)方法處理，透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)。

1.4 各組小鼠BALF、血清TSLP檢測 采用ELISA法。取各組小鼠BALF、血清，ELISA法檢測TSLP，所有操作均嚴格按照試劑說明書進行。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線，用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代人方程式，計算出樣品相對濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。重復3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理改變 光鏡下可見，A組小鼠肺組織炎癥明顯，支氣管周圍有大量的炎癥細胞浸潤，B、C組肺組織炎性細胞浸潤減少，輕于A組，D組小鼠肺組織無炎癥改變。電鏡下A組小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變明顯，B、C組小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變類似，均輕于A組，D組肺組織超微結(jié)構(gòu)無明顯改變。見圖1、2。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色(×200)

注：A1為哮喘模型組肺泡腔內(nèi)活化的巨噬細胞;A2為哮喘模型組肺泡Ⅱ型上皮細胞板層小體空泡化明顯；B1為DXM組肺泡肺泡Ⅱ型上皮細胞微絨毛基本完整;B2為DXM組肺泡隔結(jié)構(gòu)基本恢復正常;C1為CpGOND肺泡Ⅱ型上皮細胞結(jié)構(gòu)基本恢復正常;C2為CpG治療組電鏡顯示肺泡Ⅱ型上皮細胞板層小體基本恢復正常;D1、D2為對照組正常的肺泡Ⅱ型上皮細胞及板層體。圖2 各組小鼠肺組織電鏡圖像(圖A1、C2、D2×25 000,圖A2、B1、B2、C1及D1×10 000)

2.2 各組小鼠BALF、血清中TSLP水平比較 A、B、C、D組BALF中TSLP水平分別為(2.481±0.152)、(2.263±0.122)、(2.483±0.191)、(2.483±0.280)pg/mL，與 A、C、D組比較，B組小鼠BALF中TSLP水平低(P均<0.05)。A、B、C、D組血清TSLP水平分別為(2.739±0.127)、(3.028±0.142)、(3.556±0.102)、(2.560±0.096)pg/mL，與D組比較，A、B、C組血清TSLP水平升高(P均<0.05)，A、B、C組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

TSLP由Friend等[6]于1994年首次報道，是一種新型的白細胞介素7(IL-7)樣細胞因子，屬于IL-2家族，主要由上皮細胞、氣道平滑肌細胞、角質(zhì)細胞、基質(zhì)細胞、成纖維細胞、肥大細胞、巨噬/單核細胞、中性粒細胞及樹突細胞(DCs)表達[7，8]。人TSLP編碼基因位于5q21.1染色體，主要存在短型、長型2種同源異構(gòu)體，前者有60個氨基酸組成，后者編碼159個氨基酸[9，10]。鼠TSLP基因定位于第18號染色體，由140氨基酸組成。盡管人和鼠TSLP在基因和蛋白水平上僅有56%和43%的同源性，但其生物學功能卻非常相似[11，12]。TSLP受體(TSLPR)屬于造血細胞因子受體家族成員，功能性TSLPR復合物是由TSLPR和IL-7Rα組成。TSLP與其特異性受體TSLPR及IL-7Ra結(jié)合，形成三元復合物，啟動信號傳導[8]。TSLP-TSLPR-IL-7Rα復合體可作用于多種細胞系，特別是髓樣DCs，上調(diào)DCs主要組織相容性復合物(MHC)Ⅱ類、OX40配體(OX40L/CDl34L，CD252)、CD54、CD80、CD83和CD86以及激活標記物DC-LAMP的表達，促進DCs的成熟，從而誘導CD4+T細胞(Th0)分化為Th2細胞[13]，Th2效應細胞可分泌大量炎性因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)以及GM-CSF，促進B細胞生成IgE、肥大細胞脫顆粒和黏液高分泌，引起氣道炎癥和氣道高反應性。Th2記憶細胞上MHC Ⅱ類相關抗原與B細胞受體結(jié)合，激活協(xié)同刺激分子CD40和CD40L，促進IgM向IgE轉(zhuǎn)換。TSLP還可顯著抑制Treg功能，導致抗炎細胞因子IL-10水平降低[14]。但經(jīng)TSLP處理的DCs不產(chǎn)生促進Thl型細胞分化的細胞因子IL-12或促炎癥因子TNF-α、IL-lβ和IL-6，這是TSLP構(gòu)建Th2免疫微環(huán)境的關鍵特征[13]。研究發(fā)現(xiàn)，TSLP的基因啟動區(qū)包含NF-κB結(jié)合位點，亦包含誘導TSLP表達的順式調(diào)控元件，NF-κB結(jié)合位點是TSLP的啟動子。在人氣道上皮細胞中，促炎因子IL-lβ和TNF-α可通過NF-κB信號途徑調(diào)節(jié)TSLP表達[15]；能使Toll樣受體興奮的因素即可通過NF-κB途徑刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生TSLP[15，16]。本研究結(jié)果顯示，哮喘組EILSA法檢測BAFL中TSLP沒有明顯升高，與理論預計及Zhou等[5]研究獻報道不符，考慮可能與造模有關及TSLPR的表達有關。哮喘組血清中TSLP明顯升高，Zhou 等[5]也曾用EILSA法檢測哮喘小鼠血清TSLP表達，但未檢測出結(jié)果。王淑麗等[17]報道哮喘小鼠血清TSLP表達升高，究竟是局部TSLP影響血清TSLP表達，還是血清TSLP加重局部炎癥反應，尚需進一步研究。

DXM是一種強有效的糖皮質(zhì)激素，能抑制多種免疫效應細胞的功能，從而抑制各種細胞因子的合成與分泌。糖皮質(zhì)激素與其受體結(jié)合后能降低NF-κB、AP-1活性，致促炎癥因子如前列腺素、IL-1、IL-6、TNFa等表達減少，而抗炎癥因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子等表達增加，從而發(fā)揮糖皮質(zhì)激素的抗炎等生物學效應[18]。Lee等[15]報道IL-lβ和TNFa能夠誘導TSLP的表達和釋放，進一步研究TSLP基因啟動因，發(fā)現(xiàn)IL-lβ和TNFa可通過NF-κB途徑活化TSLP啟動基因，而加入核因子NF-κB阻滯劑后，TSLP表達明顯減少。因此推測，DXM抑制TSLP的合成與分泌的機制可能是通過抑制IL-1、TNFa的合成，降低NF-κB活性實現(xiàn)的。本實驗結(jié)果顯示DXM組BAFL中TSLP明顯降低，與其余三組相比，有顯著性差異，提示DXM局部作用機可能是通過降低NF-κB活性，減少IL-lβ和TNFa分泌，從而抑制TSLP的表達。但DXM組血清中TSLP水平較A、B組明顯升高，與小鼠致敏、激發(fā)時出現(xiàn)的癥狀不符，提示DXM和(或)TSLP全身同局部作用機制不同，為進一步研究DXM、TSLP在變應性疾病中的作用提供理論依據(jù)。

作為強有力的免疫反應刺激序列，CpGODN對哮喘氣道炎癥的抑制作用得到了廣泛的關注。多個實驗模型表明CpGODN具有預防及治療哮喘的作用。CpGODN通過TLR9的特異性識別，可誘發(fā)信號傳導途徑，激活多種不同的轉(zhuǎn)錄因子，包括NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，進而刺激B細胞增殖，誘導Th1型細胞因子如IL-12、IFN-γ、IL-6、TNF-α等的分泌，從而誘導Th1型免疫應答[1,19]。研究[15，16]發(fā)現(xiàn)，能使Toll樣受體興奮的因素即可通過NF-κB途徑刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生TSLP。既然CpGODN可以活化TLR9，理論上即可激活NF-κB，應該可以升高TSLP表達，加重哮喘的癥狀，但是我們前面已述，TSLP構(gòu)建Th2免疫微環(huán)境的關鍵特征，是經(jīng)TSLP處理的DCs不產(chǎn)生促進Thl型細胞分化的細胞因子IL-12或促炎癥因子TNF-α、IL-lβ和IL-6。Tomoki等[20]通過對靜止DC、CD40L-DC、TSLP-DC基因表達譜的分析，發(fā)現(xiàn)TSLP能夠誘導DC表達TNF超家族蛋白OX40L，后者通過與T細胞表面受體OX40相互作用，在沒有IL-12的作用下促進Th2細胞的產(chǎn)生。當有IL-12存在時，OX40L不能誘導產(chǎn)生炎癥Th2細胞，失去啟動炎癥Th2細胞產(chǎn)生的能力。CpGODN雖然可以通過激活NF-κB，誘導TSLP的表達，但是CpGODN可誘導Th1型細胞因子IL-12的分泌，使TSLP失去構(gòu)建Th2免疫微環(huán)境的能力，不能產(chǎn)生以Th2為優(yōu)勢的免疫應答，由此可以推測CpGODN干預使小鼠哮喘癥狀減輕，部分機理可能是通過阻斷TSLP介導的免疫應答實現(xiàn)的。在本實驗結(jié)果顯示，CpGODN組BAFL中TSLP無明顯升高，同A組、B組比較無顯著性差別，血清中TSLP升高明顯，小鼠的哮喘癥狀反而減少，提示CpGODN局部同全身作用機制可能不同；CpGODN可能拮抗了TSLP的生物學作用。為CpGODN防治哮喘提供了新的理論依據(jù)及新的研究途徑。

綜上所述，腹腔注射CpGODN可減輕急性哮喘小鼠肺組織炎癥水平，其機制可能為影響小鼠BALF、血清TSLP的生物學效應有關。哮喘的發(fā)病機制復雜，CpGODN在哮喘發(fā)病中的免疫活性作用可能存在多種不同的調(diào)節(jié)機制，彼此之間存在復雜的網(wǎng)絡聯(lián)系，與TSLP之間相互作用機制仍待進一步研究探討。