高寶榮,劉虹

1四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，成都 610041；2 天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院

卵巢癌是女性三大常見的生殖器惡性腫瘤之一，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是目前臨床治療卵巢癌的主要方法。但卵巢癌細(xì)胞然而臨床實踐中發(fā)現(xiàn)化療藥物耐藥是卵巢癌治療效果不佳的主要原因[1]。降低或逆轉(zhuǎn)卵巢癌癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性一直是該領(lǐng)域的研究熱點。米非司酮(mifepristone, MIF)是一種孕激素拮抗劑，目前臨床將其用于胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和白血病等疾病的治療中，具有抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性等作用[2]。關(guān)于MIF在逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥方面的研究較少。2019年1月起，我們測算了MIF對人上皮性卵巢癌耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP細(xì)胞的非細(xì)胞毒性劑量，以此為逆轉(zhuǎn)劑量，觀察加入逆轉(zhuǎn)劑量MIF的SKOV3/DDP對順鉑(DDP)耐藥情況，并初步探討其可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人上皮性卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、SKOV3順鉑(DDP)耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。MIF購自北京紫竹藥業(yè)有限公司，DDP購自山東齊魯制藥公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，SKOV3細(xì)胞傳代時間2～3 d，SKOV3/DDP細(xì)胞傳代時間5～7 d。SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞傳2～3代后消化備用。

1.3 MIF對SKOV3/DDP的增殖抑制作用觀察及逆轉(zhuǎn)劑量選擇 采用MTT法。取對數(shù)生長期的SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為6×104/mL，將該濃度細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔加入100 μL，培養(yǎng)24 h。SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞分別分為實驗組、空白組及對照組，實驗組分別加入0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 μmol/L的MIF，每個濃度3個復(fù)孔，對照組正常培養(yǎng)，空白組只加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h時，每孔加入20 μL MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度OD值,測算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=OD實驗組/OD對照組×100%。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)所測得OD值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.625～40 μmol/L的MIF均可抑制SKOV3、SKOV3/DDP的細(xì)胞增殖，MIF濃度與細(xì)胞增殖抑制率的相關(guān)系數(shù)分別為0.779、0.881，呈線性相關(guān)，隨著MIF濃度的增加，細(xì)胞的抑制率增加。繪制量-效曲線，選取SKOV3、SKOV3/DDP增殖抑制率均<5%的MIF濃度，并將此作為逆轉(zhuǎn)劑量。

1.4 DDP對SKOV3/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度及細(xì)胞耐藥指數(shù)測算 采用MTT法,細(xì)胞培養(yǎng)及實驗方法均同“1.3”。取適量SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞，分別分為實驗組、空白組及對照組，實驗組分別加入100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 μg/mL的DDP,對照組正常培養(yǎng)，空白組只加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h時，加入20 μL MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度OD值,測算細(xì)胞增殖抑制率，進(jìn)一步計算兩種細(xì)胞對DDP的半數(shù)抑制濃度(IC50)，計算SKOV3/DDP細(xì)胞耐藥指數(shù)(RI)。RI=IC50(SKOV3/DDP)/IC50(SKOV3)。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 逆轉(zhuǎn)劑量的MIF對SKOV3/DDP的耐藥性逆轉(zhuǎn)作用、細(xì)胞周期影響觀察

1.5.1 逆轉(zhuǎn)劑量的MIF對SKOV3/DDP的耐藥性逆轉(zhuǎn)作用觀察 MTT法測算MIF對SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。取適量SKOV3/DDP細(xì)胞，分為A、B兩組，A組加入RI劑量DDP,B組加入4.61 μg/mL的DDP+逆轉(zhuǎn)濃度(5 μmol/L)的MIF ,細(xì)胞培養(yǎng)及實驗方法均同“1.3”，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時測算細(xì)胞IC50，計算MIF對SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal fold, RF)。RF=IC50(DDP)/IC50(DDP+MIF)。

1.6 逆轉(zhuǎn)劑量的MIF對SKOV3/DDP的細(xì)胞周期影響觀察 取對數(shù)生長期SKOV3/DDP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，接種于6孔板，加入5 μmol/L的MIF ，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇固定細(xì)胞，并吹打成細(xì)胞懸液，4 ℃固定過夜。2 000 r/min離心10 h，用PBS再洗滌細(xì)胞1次，加入500 μL的PBS[含50 μg/mL碘化丙啶(PI)，100 μg/mL Rnase A，0.2%Triton X-100]，4 ℃避光孵育30 min。用50 μm尼龍網(wǎng)過濾樣品后上機(jī)檢測，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 加入不同濃度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率比較及MIF逆轉(zhuǎn)劑量 加入不同濃度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。進(jìn)一步得到，MIF對SKOV3/DDP的逆轉(zhuǎn)劑量為5 μmol/L。

表1 加入不同濃度MIF的SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 DDP對SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50及RI DDP對SKOV3、SKOV3/DDP的IC50分別為3.22、14.83 μg/mL，SKOV3/DDP細(xì)胞對DDP的RI為4.61。

2.3 MIF對SKOV3/DDP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用 培養(yǎng)24、48、72 h時A組IC50分別為(23.13±0.83)、(14.83±0.52)、(10.07±0.56)μg/mL；B組分別為與(17.06±0.53)、(7.77±0.47)、(4.06±0.69)μg/mL，MIF對SKOV3/DDP細(xì)胞耐藥性的RF分別為1.36、1.91、2.48倍。2.4 加入MIF的SKOV3/DDP細(xì)胞周期比較 培養(yǎng)24、48、72 h時，加入MIF的SKOV3/DDP細(xì)胞G0/G1期所占比例分別為48.7%、53.9%、55.1%、59.0%，S期所占比例分別為13.5%、9.6%、7.7%、5.8%，G2/M期所占比例分別為37.8%、36.5%、37.2%、35.2%。

3 討論

卵巢腫瘤的病死率居婦科惡性腫瘤首位，手術(shù)聯(lián)合化療使晚期卵巢癌患者的近期生存率有了明顯提高，但治療后患者5年生存率仍為25%～30%。多數(shù)卵巢癌患者在治療初始階段對化療較敏感，但是隨著療程的延續(xù)逐漸出現(xiàn)獲得性耐藥，如何逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥對提高卵巢癌患者生存率至關(guān)重要。傳統(tǒng)改善耐藥性主要有兩種方法：一是尋找對耐藥細(xì)胞更為有效的抗腫瘤藥物；另一種是通過增加細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度逆轉(zhuǎn)耐藥性。

MIF作為一種孕激素和糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑，臨床上主要作為一種計劃生育類用藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)MIF還具有一定程度的抗腫瘤作用，可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期等有關(guān)。Cui等[3]觀察到在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，MIF能夠阻斷孕激素對凋亡抑制基因胰島素樣受體-2的上調(diào)，從而抑制癌細(xì)胞的生長。MIF還能夠顯著抑制體內(nèi)移植瘤的生長，且在激素受體陰性的腫瘤中也具有相同的抑制作用[4～6]。不僅如此，在耐藥的腫瘤細(xì)胞中，MIF也同樣能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。Gamarra-Luques等[7]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞系IGROV-1及 SKOV-3經(jīng)順鉑-紫杉醇耐藥處理前后，它們對MIF均顯示出相似的敏感性，這種敏感性以劑量相關(guān)的方式阻礙了它們的生長。本研究中也得到了類似的結(jié)論，我們所采用的SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞系均為孕激素受體表達(dá)陰性的細(xì)胞系，且SKOV3/DDP為順鉑耐藥細(xì)胞，經(jīng)MIF作用后，兩種細(xì)胞的生長均受到不同程度的抑制，呈劑量依賴性。

既往研究及本研究結(jié)果，均可看出MIF不同于強(qiáng)效的化療藥物，其對腫瘤細(xì)胞的抑制程度較低。因此，在基礎(chǔ)和臨床研究中，常將MIF作為一種增敏劑與細(xì)胞毒性藥物或激素類藥物聯(lián)合，起到協(xié)同或增敏的效果[8]。Jurado等[9]在宮頸癌Hela細(xì)胞的體內(nèi)、體外研究中發(fā)現(xiàn)，MIF聯(lián)合順鉑作用于Hela細(xì)胞后，其細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度較順鉑單獨作用時增加了2倍，同樣，裸鼠體內(nèi)移植瘤中及血漿內(nèi)順鉑的濃度也明顯升高，藥物的AUC曲線下面積及半衰期分別增加了17%和30%。研究[10]發(fā)現(xiàn)，MIF的代謝產(chǎn)物美他普利酮也具有類似的效果，可以增加細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，從而增加細(xì)胞毒性。這種增敏作用對于耐藥細(xì)胞而言，在一定程度上能夠起到逆轉(zhuǎn)耐藥效果。在其他腫瘤，如乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等的耐藥研究中均發(fā)現(xiàn)MIF具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用[2]。如Chen等[11]在宮頸癌的體外研究中發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L的MIF可使Hela/MMC細(xì)胞對MMC的耐藥指數(shù)從5.02降至1.46。國內(nèi)劉國艷等[12]在卵巢癌順鉑耐藥COC1/DDP細(xì)胞的體外研究中發(fā)現(xiàn)，隨著MIF濃度的增加，COC1/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性逐漸下降，且在10 μmol/L的水平時，耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性可以達(dá)到并超過相應(yīng)敏感株水平。國外研究[13]發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L的MIF對卵巢癌細(xì)胞生長無影響，且能成功逆轉(zhuǎn)耐藥。本研究在MIF對SKOV3、SKOV3/DDP兩種細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的量—效曲線中同樣發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L的MIF無論對耐藥細(xì)胞還是非耐藥細(xì)胞抑制率均<5%，且在耐藥細(xì)胞中該濃度與低濃度組相比細(xì)胞抑制率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，表明此濃度的MIF在耐藥細(xì)胞中無直接抑制瘤作用，主要是通過改善腫瘤細(xì)胞對DDP的敏感性，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性。在乳腺癌耐藥MCF/ADM細(xì)胞中，黃俊輝等[14]發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)劑量5 μmol/L的MIF可將細(xì)胞對ADM的耐藥指數(shù)下降約8.78倍。在將MCF/ADM細(xì)胞進(jìn)行裸鼠體內(nèi)移植形成移植瘤后，5 μmol/L的MIF與ADM聯(lián)合使用時裸鼠體內(nèi)移植瘤的體積顯著低于單用ADM組的瘤體積。本研究也發(fā)現(xiàn)MIF作用于SKOV3/DDP細(xì)胞后，耐藥指數(shù)下降，隨著時間的延長，逆轉(zhuǎn)耐藥效果越強(qiáng)。

對腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)的研究歸根結(jié)底要從耐藥產(chǎn)生的機(jī)制上進(jìn)行探索。以往關(guān)于MIF對腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究主要集中在耐藥基因及相關(guān)耐藥蛋白的表達(dá)上，如MIF能夠誘導(dǎo)P-gp表達(dá)降低，抑制藥物外排，逆轉(zhuǎn)耐藥。本研究則從凋亡的角度出發(fā)，探討MIF對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的影響。耐藥的腫瘤細(xì)胞常伴隨著細(xì)胞周期從G1期到S期過渡的增加[15]。Gaddy等[16]發(fā)現(xiàn)MIF單獨或與4-OHT聯(lián)合作用耐藥細(xì)胞系MCF-7.0.3及MCF-7.3.28后，與對照組相比，G1期比例明顯增加，S期減少，細(xì)胞周期受阻于G0/G1期。本研究中，5 μmol/L的MIF作用于SKOV3/DDP后，隨培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞周期中G0/G1期所占的比例逐漸增加，S期所占的比例減少，表明細(xì)胞周期受阻于G0/G1期，這可能是MIF逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的原因。

綜上所述，加入5 μmol/L的MIF可抑制SKOV3/DDP的細(xì)胞增殖，5 μmol/L的MIF可減輕SKOV3/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。MIF減輕SKOV3/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性機(jī)制可能為MIF可將SKOV3/DDP的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。