樊成輝，張陽(yáng)，姜華茂

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000

膀胱癌發(fā)病率占最常見(jiàn)惡性腫瘤的第10位[1]。近年來(lái)，膀胱癌的治療方法具有多樣性，包括經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)、根治性膀胱切除術(shù)、化療、免疫療法[2]。目前，國(guó)內(nèi)外膀胱癌的主要治療方法是手術(shù)聯(lián)合膀胱內(nèi)化療，經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除(TURBT)是多數(shù)膀胱癌的首選治療方法，但TURBT對(duì)術(shù)者的要求高，且手術(shù)治療后患者復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均較高[3]。為降低腫瘤復(fù)發(fā)率，臨床常在手術(shù)切除腫瘤的同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用化療，不良反應(yīng)較大[4]。目前，中藥在腫瘤治療中的藥用價(jià)值[5]已成為目前的研究熱點(diǎn)。異土木香內(nèi)酯主要來(lái)源于菊科植物土木香的根部，可促進(jìn)多種惡性腫瘤的細(xì)胞凋亡。但是關(guān)于異土木香內(nèi)酯對(duì)膀胱癌凋亡的影響相關(guān)研究甚少。2019年3月～2020年2月，我們體外培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞株T24，觀(guān)察異土木香內(nèi)酯對(duì)T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、材料和儀器 T24細(xì)胞購(gòu)自上海富衡公司；培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃，濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞融合度80%～90%時(shí)0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天細(xì)胞傳代。異土木香內(nèi)酯(純度>98%)購(gòu)自北京索萊寶公司，按照說(shuō)明書(shū)，使用DMSO溶解異土木香內(nèi)酯配制成終濃度為80 nmol/L的母溶液，使用時(shí)稀釋相應(yīng)濃度，DMSO終濃度<0.1%。N-乙酰半胱氨酸(NAC，一種抗氧化劑)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，將NAC粉末溶解于雙蒸水中，配置成1 mol/L的溶液，使用時(shí)培養(yǎng)基稀釋成5 nmol/L，母溶液均過(guò)濾除菌后-20 ℃保存?zhèn)溆?。JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、PBS溶液購(gòu)自北京索萊寶公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。兔多克隆Bax、Bcl-2、Cytochrome C、 Caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；鼠單克隆β-Actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗購(gòu)自北京博奧森公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細(xì)胞增殖情況觀(guān)察 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1×105/mL，將其接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為1、2、3、4、5、6組，1、2、3、4、5組(實(shí)驗(yàn)組)分別加入5、10、20、40、80 μmol/L的異土木香內(nèi)酯，6組加入正常培養(yǎng)液(對(duì)照)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，取各組細(xì)胞， 吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入含10 μL的CCK-8試劑培養(yǎng)基100 μL，2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處光密度(OD)值，測(cè)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)]×100%。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)增殖抑制率進(jìn)一步測(cè)算出異土木香內(nèi)酯作用24 h時(shí)T24細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為22.45 μmol/L，并將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細(xì)胞凋亡情況觀(guān)察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞，1×105/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為A組(對(duì)照)、B組(5 nmol/L NAC)、C組(10 μmol/L異土木香內(nèi)酯)、D組(20 μmol/L異土木香內(nèi)酯)及E組(5 nmol/L NAC+20 μmol/L異土木香內(nèi)酯)，每組6個(gè)復(fù)孔。A組加入不含異土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)液培養(yǎng)，B、E組先加入5 nmol/L的NAC預(yù)處理培養(yǎng)2 h，C、D、E組分別加入10、20、20 μmol/L的異土木香內(nèi)酯，培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化離心收集細(xì)胞，PBS離心清洗2次。制細(xì)胞懸液，分別加入5 μL Annexin V-FITC結(jié)合物和5 μL的PI Solution，室溫下避光培養(yǎng)15 min。加入400 μL 1×Annexin V Binding Solution，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)，測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細(xì)胞活性氧簇(ROS)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。參照“1.3”對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理。制細(xì)胞懸液，加入500 μL預(yù)先稀釋的 DCFH-DA 熒光探針 37 ℃染色 ，避光孵育30 min，PBS洗2次后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞ROS含量水平，其平均熒光強(qiáng)度可間接反映ROS含量。熒光強(qiáng)度越高,反映ROS含量越多。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè) 采用JC-1染色法檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位。參照“1.3”對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理。制細(xì)胞懸液，加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液和1 mL的JC-1染色液充分混勻，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育25 min，室溫下離心收集細(xì)胞，用JC-1 染色緩沖液(1×)清洗2次，吸取500 μL JC-1 染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位。JC-1熒光探針檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位，JC-1 聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)內(nèi),形成聚合物為紅色熒光，即線(xiàn)粒體膜電位較高；JC-1不能形成聚合物而形成單體時(shí)為綠色熒光，即線(xiàn)粒體膜電位較低，計(jì)算JC-1綠色熒光單體所占百分比(間接反映線(xiàn)粒體膜電位變化),綠色熒光單體越多，反映線(xiàn)粒體膜電位越低。重復(fù)3次，取平均值。

1.6 加入異土木香內(nèi)酯培養(yǎng)的T24細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、細(xì)胞色素C(Cytochrome C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)檢測(cè) 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞分為4組，每組6個(gè)復(fù)孔，其中3組分別加入10、20、40 μmol/L異土木香內(nèi)酯，另外1組加入不含異土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)液處理(對(duì)照組)，培養(yǎng)24 h時(shí)收集各組細(xì)胞，加入 0.1 mL 含有蛋白酶抑制劑的RIPA 細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min，低溫高速離心機(jī)中離心，取上清液，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)結(jié)果制樣。進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離,冰浴下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上,采用 5%脫脂奶粉封閉 1 h, 兔多克隆Bax、Bcl-2、Cytochrome C、 Caspase-3一抗(1:1 000稀釋)鼠單克隆β-Actin一抗(1∶10 000稀釋) 4 ℃孵育過(guò)夜,次日TBST清洗3次，二抗(1∶10 000稀釋) 孵育2 h，ECL采用化學(xué)發(fā)光顯影，通過(guò)凝膠成像檢測(cè)各組Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3蛋白。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組細(xì)胞增殖抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率比較見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)24 h時(shí)A、B、C、D、E組細(xì)胞凋亡率分別為6.59%±1.22%、8.53%±1.015、20.72%±2.11%、43.21%±2.20%、8.32%±2.78%,與A組比較，C、D組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與C組比較,D組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與D組比較，E組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞ROS含量比較 培養(yǎng)24 h時(shí)A、B、C、D、E組細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度分別為997±236、1 699±315、4 609±548、10 026±605、1 831±307，與A組比較，C、D組細(xì)胞ROS含量升高(P<0.05)；與C組比較,D組細(xì)胞ROS含量升高(P<0.05)；與D組比較，E組細(xì)胞ROS含量降低(P<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位比較 培養(yǎng)24 h時(shí)A、B、C、D、E組細(xì)胞線(xiàn)粒體中綠色熒光單體百分比分別為11.30%±1.32%、12.34%±1.66%、27.19%±1.19%、52.61%±2.11%、21.94%±1.02%，與A組比較，C組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位降低(P<0.05)；與C組比較,D組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位降低(P<0.05);與D組比較，E組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位升高(P<0.05)。

2.5 各組細(xì)胞Bax、 Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，每年估計(jì)有549 000例新發(fā)病例(占癌癥新發(fā)病例3%)和200 000例死亡病例(占癌癥死亡人數(shù)2%)。膀胱癌在男性中更為常見(jiàn)，其發(fā)病率和病死率分別為9.6/10萬(wàn)和3.2/10萬(wàn)，約是女性的4倍。膀胱癌的發(fā)病原因相當(dāng)復(fù)雜，除了某些接觸化學(xué)和水污染的職業(yè)外，吸煙是膀胱癌發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素之一[6]。

植物用于癌癥治療的歷史悠久，已經(jīng)有3 000多種植物用于治療癌癥，人們不斷研究大自然中各種生物形式的提取物以尋找抗癌化合物[7]。研究膀胱癌分子靶點(diǎn)治療藥物仍然是當(dāng)前一大熱點(diǎn)。異土木香內(nèi)酯屬倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，提取自菊科旋覆花屬植物土木香的根部，具有廣泛的藥理學(xué)作用，作為治療癌癥的藥物具有巨大的潛力[8]。異土木香內(nèi)酯藥理學(xué)研究表明具有驅(qū)蟲(chóng)、抗菌、抗真菌、抗腫瘤、抗炎、抗損傷、降血糖、止痛、保護(hù)神經(jīng)等效果[9，10]。在此,我們主要研究異土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)T24細(xì)胞增殖、凋亡的初步機(jī)制。

細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)維持人體功能非常重要。因此,誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡機(jī)制相關(guān)研究已成為了抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞生物進(jìn)行氧化代謝的細(xì)胞器,不僅為各種細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量,而且參與了多種生物學(xué)過(guò)程，在能量代謝過(guò)程中線(xiàn)粒體產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS可作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[11]。ROS通常被認(rèn)為是氧消耗和細(xì)胞代謝的副產(chǎn)品，主要由正常細(xì)胞中的線(xiàn)粒體氧代謝產(chǎn)生，是參與維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的重要分子，包括超氧基(O2·)、羥自由基(OH)、過(guò)氧化氫(H2O2)、單氧分子等[12]。一定情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS含量能夠體現(xiàn)氧化還原的程度，從而決定細(xì)胞的存活，在低濃度下，ROS誘導(dǎo)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖以及存活, 在中等濃度時(shí)，ROS可以誘導(dǎo)暫時(shí)或永久的細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞分化, 然而，在較高濃度下，ROS會(huì)破壞蛋白質(zhì)、DNA、RNA等細(xì)胞生物分子，并導(dǎo)致突變從而促進(jìn)正常細(xì)胞或癌細(xì)胞凋亡[13]。ROS還可以作為激活線(xiàn)粒體途徑的信號(hào)通路的第二信使，可以激活線(xiàn)粒體內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中蛋白Bcl-2家族，Bcl-2家族成員包括促凋亡蛋白因子Bax和抗凋亡蛋白因Bcl-2因子[14]。ROS通過(guò)下調(diào)線(xiàn)粒體外膜的Bcl-2家族蛋白表達(dá)，促使促凋亡因子Bax轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體上，引起線(xiàn)粒體膜過(guò)氧化破壞,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位下降,啟動(dòng)線(xiàn)粒體途徑的凋亡過(guò)程，誘導(dǎo)Cytochrome C的大量釋放進(jìn)入胞質(zhì)中，活化Caspase蛋白酶家族,引起細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng),使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨異土木香內(nèi)酯藥物濃度增加，細(xì)胞增殖抑制明顯，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增加，JC-1綠色熒光單體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。應(yīng)用ROS清除劑NAC后，可以減弱異土木香內(nèi)酯對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)ROS含量、線(xiàn)粒體膜電位的影響。說(shuō)明了異土木香內(nèi)酯在引起T24細(xì)胞ROS的大量積聚后,ROS引起了線(xiàn)粒體膜的過(guò)氧化破壞,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率上升，細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位下降,啟動(dòng)了細(xì)胞線(xiàn)粒體途徑的凋亡過(guò)程。 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明異土木香內(nèi)酯能上調(diào)Bax、Cytochrome C、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量，下調(diào)Bcl-2相對(duì)表達(dá)量，從而發(fā)揮其抗癌作用。

綜上所述,異土木香內(nèi)酯可抑制T24細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為異土木香內(nèi)酯作用T24細(xì)胞后，提高細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,降低細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位，促進(jìn)Bax、Cytochrome C、Caspase-3表達(dá)。異土木香內(nèi)酯對(duì)其腫瘤的作用機(jī)制及其在人體內(nèi)的藥理作用有待進(jìn)一步研究,有望開(kāi)、作用發(fā)成為以線(xiàn)粒體凋亡途徑為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥。