段云

（烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

1 前言

左乙拉西坦是當(dāng)前報(bào)道的唯一具有預(yù)防癲癇發(fā)病的抗癲癇藥品，于1999 年首次被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)在美國(guó)上市。由于效果好、副作用低，其在全球范圍內(nèi)的應(yīng)用越來(lái)越廣，目前主要用于年齡大于或等于1 個(gè)月的兒童與成人癲癇患者部分性發(fā)作的輔助治療藥[1-3]。 左乙拉西坦氯化鈉注射液是由左乙拉西坦（C8H14N2O2）和氯化鈉組成的注射液制劑，對(duì)于暫時(shí)不能口服左乙拉西坦的癲癇患者，本品提供了一個(gè)很好的選擇。 左乙拉西坦為手性藥物，其右旋異構(gòu)體-右乙拉西坦（圖1）對(duì)于抑制癲癇發(fā)作只有輕微或不明顯的藥效作用，因此需控制其右旋異構(gòu)體的含量。 目前有關(guān)左乙拉西坦中異構(gòu)體的測(cè)定已有報(bào)道，但對(duì)其制劑中異構(gòu)體的檢測(cè)文獻(xiàn)很少[4-6]。 本文建立了左乙拉西坦氯化鈉注射液中異構(gòu)體含量的高效液相色譜法，該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為左乙拉西坦氯化鈉注射液異構(gòu)體的準(zhǔn)確定量提供參考。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

電子天平（梅特勒AB135-S）；高效液相色譜儀（日本島津-紫外檢測(cè)器高效液相色譜儀，色譜柱為CHIRALPAK IC 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

圖1 右乙拉西坦的分子式

2.2 試劑

無(wú)水乙醇（色譜純，MREDA）；乙酸銨（分析純）；左乙拉西坦氯化鈉注射液 （小試批樣品批號(hào)：20130501、20130504、20130507； 中試批樣品批號(hào)：20131201、20131202、20131203；北大醫(yī)院重慶大新藥業(yè)有限公司）。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

采用 CHIRALPAK IE 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以 10 mmol 乙酸銨水溶液（乙酸銨 0.77 g，加水 1 000 mL 溶解）-無(wú)水乙醇（80∶20）為流動(dòng)相，流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣體積 10 μL，運(yùn)行 30 min，進(jìn)行測(cè)定。

3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察

貯備液：精密稱(chēng)取左乙拉西坦對(duì)照品10.03 mg，置于100 mL 量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

左乙拉西坦線(xiàn)性溶液配制：分別精密吸取貯備液適量，加溶劑稀釋成濃度為每1 mL 中含左乙拉西坦 0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg 的溶液。

精密吸取上述配制溶液各10 μL 分別注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。 以濃度（C）為橫坐標(biāo)（X 軸），以峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y 軸），得到濃度和峰面積的回歸方程為：Y=18.3201X+0.2909，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 9。結(jié)果表明，左乙拉西坦異構(gòu)體在 0.50～10.02 μg/mL 具有良好的線(xiàn)性關(guān)系， 試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

圖2 左乙拉西坦異構(gòu)體線(xiàn)性關(guān)系圖

3.3 專(zhuān)屬性考察

3.3.1 空白輔料干擾

稱(chēng)取空白輔料500 mg 規(guī)格2 mL 置于10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度；空白輔料1 000 mg 規(guī)格1 mL 置于10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度；空白輔料1 500 mg 規(guī)格3 mL 置于50 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為空白輔料溶液。分別精密吸取10 μL 溶液注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，空白輔料不干擾本品異構(gòu)體檢測(cè)。

3.3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

稱(chēng)取左乙拉西坦消旋體適量，加入流動(dòng)相制成1 mg/mL 的系統(tǒng)適用性溶液。 精密吸取系統(tǒng)適用性溶液10 μL 注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在該色譜條件下，色譜柱的理論板數(shù)（n）較高，分離度大于1.5，符合常規(guī)測(cè)定要求，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 異構(gòu)體方法-系統(tǒng)適用性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品適量（500 mg 規(guī)格樣品 2 mL，1 000 mg規(guī)格 1 mL，1 500 mg 規(guī)格 0.6 mL），置于 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。 分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣檢測(cè)，以檢測(cè)主峰面積和異構(gòu)體峰面積的變化情況衡量供試品溶液穩(wěn)定性。結(jié)果表明，本品在室溫放置12 h 內(nèi)，主峰面積及異構(gòu)體峰面積均無(wú)明顯變化，說(shuō)明本方法溶液穩(wěn)定性良好，符合常規(guī)分析要求，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 3 批樣品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品適量（500 mg 規(guī)格樣品 2 mL，1 000 mg規(guī)格 1 mL，1 500 mg 規(guī)格 0.6 mL），置于 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。 分別配制6 份，以樣品中檢測(cè)到的異構(gòu)體峰面積為指標(biāo)，驗(yàn)證本方法的重復(fù)性，結(jié)果表明，平行配制6 份樣品，異構(gòu)體雜質(zhì)含量無(wú)明顯變化，表明該方法重復(fù)性良好，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 3 批樣品溶液重復(fù)性考察結(jié)果

3.6 精密度試驗(yàn)

取本品適量（500 mg 規(guī)格樣品 2 mL，1 000 mg 規(guī)格 1 mL，1 500 mg 規(guī)格 0.6 mL），置于 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。 連續(xù)進(jìn)樣6 針，計(jì)算峰面積的RSD。 在該色譜條件下，左乙拉西坦注射液異構(gòu)體對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，其保留時(shí)間及峰面積的RSD 小于2.0%，表明本色譜條件進(jìn)樣精密度良好，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表4。

3.7 檢測(cè)限試驗(yàn)

稱(chēng)取左乙拉西坦對(duì)照品適量制成0.1 mg/mL 溶液再加溶劑逐級(jí)稀釋至適宜濃度，在上述色譜條件下，以3 倍信噪比作為檢測(cè)限，結(jié)果擬定左乙拉西坦檢查濃度為1.0 mg/mL，檢測(cè)限為0.3 ng，即異構(gòu)體在0.003%以上可被檢出，表明本品色譜條件靈敏度高，適合異構(gòu)體雜質(zhì)的控制。

3.8 定量限試驗(yàn)

稱(chēng)取左乙拉西坦對(duì)照品適量制成0.1 mg/mL 溶液再加溶劑逐級(jí)稀釋至適宜濃度，在上述色譜條件下，以10 倍信噪比作為定量限，結(jié)果擬定左乙拉西坦檢查濃度為1.0 mg/mL，定量限為1.0 ng，即異構(gòu)體在0.010%以上可定量檢測(cè)，表明本品色譜條件能準(zhǔn)確定量，靈敏度高。

表4 3 批樣品進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.9 耐用性試驗(yàn)

按照中國(guó)藥典2015 版二部附錄藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，進(jìn)行耐用性試驗(yàn)。針對(duì)本品色譜條件，主要從流動(dòng)相比例、流速和柱溫進(jìn)行耐用性試驗(yàn)。 考察異構(gòu)體檢測(cè)條件微小變化時(shí)異構(gòu)體雜質(zhì)的檢出情況，以更直觀(guān)地考察系統(tǒng)的耐用性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)整色譜系統(tǒng)（流動(dòng)相比例、流速、柱溫），本品異構(gòu)體雜質(zhì)含量均無(wú)明顯變化， 異構(gòu)體和主峰的分離度大于1.5，表明本方法耐用性良好。

3.10 3 批中試樣品異構(gòu)體檢查

取中試 3 批樣品 0.5 g/100 mL 規(guī)格（20131201、20131202、20131203）、1.0 g/100 mL 規(guī)格（20131201、20131202、20131203）、1.5 g/100 mL 規(guī)格（20131201、20131202、20131203），按照上述確定的方法依次對(duì)3 個(gè)規(guī)格3 批樣品的異構(gòu)體進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示中試3 批樣品中異構(gòu)體雜質(zhì)量均低于0.8%，符合規(guī)定，測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表5。

表5 異構(gòu)體雜質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

左乙拉西坦注射液中異構(gòu)體的檢查主要依據(jù)左乙拉西坦片進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)藥典（USP）左乙拉西坦口服溶液，同時(shí)結(jié)合中國(guó)藥典2010 年版二部附錄并結(jié)合本品的性質(zhì)而定。該色譜條件系統(tǒng)適用性好，精密度高，專(zhuān)屬性好，試驗(yàn)結(jié)果顯示本品異構(gòu)體測(cè)定溶液穩(wěn)定性好，比例對(duì)異構(gòu)體雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，說(shuō)明所選色譜系統(tǒng)可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的異構(gòu)體。

本品中試3 批異構(gòu)體雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果與原料中異構(gòu)體雜質(zhì)含量相比無(wú)明顯變化，說(shuō)明本品制劑生產(chǎn)過(guò)程中異構(gòu)體雜質(zhì)含量不發(fā)生變化。 由本品影響因素試驗(yàn)及加速長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果可知，放置過(guò)程中異構(gòu)體雜質(zhì)含量無(wú)明顯變化，考慮到本品原料中需對(duì)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制，故建議本品異構(gòu)體雜質(zhì)檢查不用單獨(dú)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。

5 結(jié)論

用高效液相色譜法測(cè)定左乙拉西坦氯化鈉注射液中異構(gòu)體的含量，靈敏度高，重現(xiàn)性好，耐用性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，該法可用于測(cè)定左乙拉西坦氯化鈉注射液中異構(gòu)體的含量，可有效、準(zhǔn)確控制左乙拉西坦氯化鈉注射液的質(zhì)量。