杜佳琳，段 楠，逄 璐，黃海明，黃辰煒，李海霞

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

足細(xì)胞是錨定在腎小球基底膜的高度分化終末細(xì)胞，具有復(fù)雜的骨架結(jié)構(gòu)，是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，其損傷是導(dǎo)致腎小球蛋白尿的主要機(jī)制，并且與各類腎小球疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1]。在足細(xì)胞損傷模型中，足細(xì)胞內(nèi)某些蛋白的表達(dá)水平會發(fā)生明顯變化，特定基因的缺失會導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能受損，因此，明確導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的特定分子，對于治療腎小球疾病至關(guān)重要[2-3]。Crk家族蛋白Crk1/2與CrkL是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，二者結(jié)構(gòu)相似，功能互補(bǔ)，參與細(xì)胞黏附、遷移、增殖、凋亡及免疫等多個(gè)生物過程，在許多腫瘤疾病中呈高表達(dá)，并且對維持正常細(xì)胞的形態(tài)和功能至關(guān)重要[4]。既往研究表明，足細(xì)胞Crk1/2與CrkL缺失會導(dǎo)致板狀偽足形成異常，細(xì)胞骨架重排及細(xì)胞黏附、遷移與活力受損[5-6]。盡管Crk1/2與CrkL在足細(xì)胞中發(fā)揮了重要生物作用，但此過程中涉及的上、下游分子機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步了解Crk1/2與CrkL在足細(xì)胞中的作用，本研究采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降的足細(xì)胞和正常足細(xì)胞中的蛋白質(zhì)譜進(jìn)行比較，根據(jù)所得信息分析由Crk家族蛋白缺失介導(dǎo)的復(fù)雜蛋白網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步探索腎小球疾病的病理生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 條件永生化人足細(xì)胞(HPCs)由美國安德森癌癥中心龍慧茵教授饋贈；Opti-MEM低血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；小干擾RNA(siRNA，中國生工生物工程股份有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(美國Invitrogen公司)；抗Crk1/2抗體(美國BD公司，1∶2 000)、抗CrkL抗體(英國Abcam公司，1∶500)、抗LRP1抗體(英國Abcam公司，1∶2 000)、抗超氧化物歧化酶2(SOD2)抗體(英國Abcam公司，1∶2 000)、抗TPM4抗體(英國Abcam公司，1∶3 000)、抗c-Jun抗體(英國Abcam公司，1∶3 000)、抗Cdc42EP1抗體(英國Abcam公司，1∶4 000)、抗GAPDH抗體(英國Abcam公司，1∶2 000)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HPCs于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)的RPMI1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。增殖條件為33 ℃，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，轉(zhuǎn)入37 ℃，培養(yǎng)基去除ITS，培養(yǎng)10～14 d誘導(dǎo)分化，之后用于試驗(yàn)。

1.2.2試驗(yàn)分組及siRNA轉(zhuǎn)染 試驗(yàn)分為4組：空白對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，siCtrl)、Crk1/2單敲降組(轉(zhuǎn)染Crk1/2 siRNA，siCrk1/2)、CrkL單敲降組(轉(zhuǎn)染CrkL siRNA，siCrkL)、Crk1/2與CrkL雙敲降組(共轉(zhuǎn)染Crk1/2 siRNA與CrkL siRNA，siCrk1/2+siCrkL)。當(dāng)分化好的HPCs細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，利用Opti-MEM低血清培養(yǎng)基稀釋siRNA與Lipofectamine RNAiMAX，二者混合均勻，室溫孵育10 min后，滴加至細(xì)胞培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，采用Western blot試驗(yàn)進(jìn)行沉默效率驗(yàn)證。

1.2.3Western blot分析 轉(zhuǎn)染72 h后，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，4 ℃條件下以1 200 r/min離心15 min后取上清液用于Western blot試驗(yàn)。Western blot試驗(yàn)過程如下：將20 μg蛋白上樣至濃度為10%的分離膠中進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。轉(zhuǎn)膜完畢后用5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，之后加入一抗，4 ℃過夜。第2天復(fù)溫后用Western blot試驗(yàn)洗滌液洗膜，5 min×3次，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次用Western blot試驗(yàn)洗滌液洗膜，5 min×3次。采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影，采用Image J軟件對各條帶進(jìn)行灰度掃描。各試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析 采用Bradford方法對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量，60 μg蛋白中加入5 μL二硫蘇糖醇(1 mol/L)室溫孵育1 h，然后加入20 μL吲哚乙酸(1 mol/L)避光室溫孵育1 h，采用離心法和超濾法去除DTT、IAA和低分子物質(zhì)，按照50∶1的比例在37 ℃下孵育12～16 h進(jìn)行胰蛋白酶消化。LC-MS/MS系統(tǒng)包括Agilent 1100 quaternary高效液相色譜儀和Q-Exactive Fusion Lumos質(zhì)譜儀。樣本由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到C18反向柱(C18 3 μm 100 μm×2 cm)，再經(jīng)分析柱(C18 1.9 μm 150 μm×12 cm)分離，洗脫液A為0.1% 甲酸/H2O，洗脫液B為0.08%甲酸/乙腈，流速為300 nL/min，洗脫時(shí)間為75 min。采用數(shù)據(jù)依賴采集模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：質(zhì)譜掃描離子質(zhì)荷比為350～1 550 m/z，掃描分辨率為6 000，自動(dòng)增益控制系數(shù)(AGC)為400 000，最大離子時(shí)間為50 ms。二級質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：掃描分辨率為15 000，AGC為20 000，最大離子時(shí)間為35 ms。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Proteome Discoverer軟件在Uniprot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索鑒定。肽段和蛋白質(zhì)鑒定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率均小于0.01，允許最小肽段數(shù)目為1個(gè)。當(dāng)上調(diào)蛋白差異倍數(shù)為1.5、下調(diào)蛋白差異倍數(shù)為0.67時(shí)，視為明顯差異蛋白。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析，采用STRING數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)進(jìn)行蛋白相互作用分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。采用GraphPad Prism 6.0軟件制作統(tǒng)計(jì)圖。采用t檢驗(yàn)、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降足細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析及差異蛋白篩選 為了探究Crk1/2與CrkL在足細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用，本研究通過轉(zhuǎn)染siCrk1/2、siCrkL及siCrk1/2+siCrkL的方法實(shí)現(xiàn)足細(xì)胞內(nèi)Crk1/2與CrkL的單敲降及雙敲降。如圖1A所示，siRNAs轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后，Crk1/2與CrkL的表達(dá)水平與空白對照組比較明顯降低。為了探討Crk1/2與CrkL缺失對胞內(nèi)蛋白表達(dá)的改變，本研究對3次獨(dú)立試驗(yàn)的特異性敲降足細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，相關(guān)工作流程如圖1B所示。利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和數(shù)據(jù)庫檢索。與siCtrl組比較，siCrk1/2組有291個(gè)差異蛋白，siCrkL組有315個(gè)差異蛋白，siCrk1/2+siCrkL組有576個(gè)差異蛋白。在這些差異蛋白中，有46個(gè)蛋白在3個(gè)試驗(yàn)組中均表達(dá)上調(diào)，有52個(gè)蛋白在3個(gè)試驗(yàn)組中均表達(dá)下調(diào)，如圖1C所示。下一步將對這98個(gè)差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析。

注：A為siRNA轉(zhuǎn)染后足細(xì)胞Crk1/2與CrkL的表達(dá)情況；B為定量蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程圖；C為差異蛋白篩選。

2.2Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降足細(xì)胞中差異蛋白通路分析 為了探究Crk1/2與CrkL基因敲降相關(guān)的生物學(xué)功能和途徑，本研究對98個(gè)差異蛋白進(jìn)行了GO分析和KEGG分析。如圖2、圖3所示，生物過程分析提示大多數(shù)上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)涉及以下3個(gè)過程：(1)細(xì)胞進(jìn)程，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；(2)生物調(diào)節(jié)過程，包括細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡過程調(diào)控等；(3)代謝過程，包括脂質(zhì)代謝過程和氧化還原過程等。分子功能分析顯示，上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)主要富集在結(jié)合作用、蛋白結(jié)合、催化活性和水解酶活性等方面。此外，細(xì)胞組分分析提示，上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)主要為細(xì)胞質(zhì)成分。如圖4所示，對上調(diào)差異蛋白進(jìn)行KEGG分析顯示，多數(shù)蛋白參與代謝途徑，包括果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝等。圖5對下調(diào)差異蛋白進(jìn)行KEGG分析顯示，Crk1/2與CrkL缺失會影響足細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，包括抑制和激活蛋白1、磷脂酰肌醇三激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶和環(huán)磷酸腺苷等信號通路。這些差異蛋白的分布和功能為尋找與Crk1/2、CrkL的異常表達(dá)引起足細(xì)胞功能障礙有關(guān)的分子成分和信號通路提供了線索。

圖2 上調(diào)差異蛋白的GO分析

圖3 下調(diào)差異蛋白的GO分析

圖4 上調(diào)差異蛋白的KEGG分析

2.3Crk1/2、CrkL與差異蛋白間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系 為了進(jìn)一步分析98個(gè)差異蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，本研究將其上傳至STRING蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白與Crk1/2和CrkL之間高度互連。此外，一些軟件預(yù)測的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)也出現(xiàn)在關(guān)系網(wǎng)中。轉(zhuǎn)錄因子c-Jun是MAPK的下游激活靶點(diǎn)，有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和分化的作用。在98個(gè)差異蛋白中，c-Jun與其他差異蛋白及被預(yù)測的蛋白質(zhì)的連接數(shù)目最多，高達(dá)17個(gè)。與c-Jun相連蛋白包括SOD2、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)和酪氨酸蛋白激酶等，這些蛋白質(zhì)的連接為探究Crk1/2和CrkL缺失引起足細(xì)胞損傷和遺傳性Digeorge綜合征的機(jī)制提供了更多信息。

圖5 下調(diào)差異蛋白的KEGG分析

2.4目標(biāo)蛋白Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證 本研究選擇5個(gè)相關(guān)差異蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證，并準(zhǔn)備在下一步試驗(yàn)中繼續(xù)進(jìn)行深入的分子機(jī)制研究。如圖6所示，上述5個(gè)蛋白的Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相一致，證明了蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。

注：*P<0.05,△P<0.01,#P<0.001。

3 討 論

足細(xì)胞損傷是引起腎小球疾病的主要原因，既往研究表明，足細(xì)胞Crk家族蛋白的特異性缺失會導(dǎo)致偽足形成受阻[5-6]。為了研究Crk家族蛋白缺失引起足細(xì)胞功能障礙的分子機(jī)制，本研究分別對Crk1/2、CrkL單敲降及雙敲降的足細(xì)胞進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以識別Crk1/2與CrkL調(diào)控的差異蛋白。

通過對上調(diào)和下調(diào)差異蛋白進(jìn)行生物過程分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的大部分差異蛋白都參與了代謝途徑，如氨基糖和核苷酸代謝、半乳糖代謝、碳代謝等。近年來，足細(xì)胞代謝紊亂已成為腎小球疾病的重要因素。線粒體功能障礙和代謝異?？梢栽谔悄虿∧I病、局灶節(jié)段性腎小球硬化和慢性腎臟病中觀察到，并被認(rèn)為是腎臟疾病進(jìn)展的主要驅(qū)動(dòng)因素[7]。本研究提示，在Crk1/2和CrkL缺失導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷過程中，代謝紊亂是一個(gè)非常重要的損傷機(jī)制。對下調(diào)差異蛋白進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，大部分蛋白富集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如Rap1、cAMP和PI3K-Akt信號通路等)上。STRING分析也顯示差異蛋白與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(如mTOR、MAPK8和MAPK9等)有密切關(guān)系。因此，生物信息學(xué)分析為Crk1/2與CrkL缺失引起足細(xì)胞功能障礙的研究提供了新思路。

在98個(gè)差異蛋白中，有5個(gè)與代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌動(dòng)蛋白骨架有關(guān)的差異蛋白已被Western blot試驗(yàn)證實(shí)。TPM4是一種原肌球蛋白，是微絲骨架的主要結(jié)構(gòu)，海馬神經(jīng)元LRRK2的缺失會導(dǎo)致生長錐中產(chǎn)生更多的TPM4來穩(wěn)定新合成的肌動(dòng)蛋白微絲[8]。然而，對TPM4在腎臟疾病中的表達(dá)情況及其生物學(xué)功能還暫不清楚。本研究結(jié)果顯示，足細(xì)胞內(nèi)Crk1/2與CrkL缺失導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重排的過程伴隨著TPM4表達(dá)增加。因此，推測TPM4的表達(dá)上調(diào)可能是肌動(dòng)蛋白絲斷裂后足細(xì)胞內(nèi)的一種自我調(diào)節(jié)現(xiàn)象，其是否參與腎臟疾病的發(fā)病值得進(jìn)一步探討。

細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白SOD2為線粒體乙?；?(SIRT3)下游分子，可通過清除超氧化物來調(diào)節(jié)細(xì)胞活性氧(ROS)水平。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)醛固酮或H2O2刺激的足細(xì)胞胞內(nèi)ROS和SOD2生成增加，刺激前用人參皂苷-rg1處理足細(xì)胞可降低SOD2和ROS水平，防止足細(xì)胞損傷[9]。本研究中，SOD2在Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降足細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其可能是應(yīng)對胞內(nèi)ROS水平升高的調(diào)節(jié)機(jī)制，過多的ROS會導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂類氧化，損害足細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，Crk1/2與CrkL敲降后可能會造成足細(xì)胞內(nèi)ROS的異常表達(dá)。此外，一些膜性腎病患者足細(xì)胞SOD2表達(dá)水平增加，并可作為自身抗原，導(dǎo)致血漿中出現(xiàn)抗SOD2抗體，最終激活免疫應(yīng)答攻擊足細(xì)胞[10]。因此，控制SOD2的表達(dá)對避免足細(xì)胞損傷有重要意義，Crk1/2、CrkL缺失導(dǎo)致的足細(xì)胞SOD2表達(dá)水平升高是腎小球疾病的危險(xiǎn)因素。

LRP1是低密度脂蛋白受體家族的成員，具有超過40種不同的配體，介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，在Schwan細(xì)胞中，LRP1表達(dá)下調(diào)可通過抑制Rac1和激活RhoA來增加細(xì)胞黏附[11]。GO和KEGG分析表明，許多差異蛋白與代謝過程與信號通路有關(guān)[11]。TPM4在穩(wěn)定微絲骨架結(jié)構(gòu)中起重要作用，在3個(gè)試驗(yàn)組中均表達(dá)上調(diào)。SOD2是一種重要的線粒體抗氧化劑，為SIRT3的下游介質(zhì)，調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生，在3個(gè)試驗(yàn)組中均表達(dá)上調(diào)。LRP1是LDL受體家族的一員，參與脂蛋白代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和肌動(dòng)蛋白聚合，在3個(gè)試驗(yàn)組中均表達(dá)上調(diào)。在STRING分析中，c-Jun與其他已鑒定和被預(yù)測的蛋白質(zhì)的聯(lián)系最多，并且參與了多條信號通路，在3個(gè)試驗(yàn)組中均表達(dá)下調(diào)。Cdc42EP1作用于Cdc42下游，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲聚合和偽足形成[11]，在3個(gè)試驗(yàn)組中均表達(dá)下調(diào)。本研究中對足細(xì)胞進(jìn)行Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降后，LRP1表達(dá)水平明顯增加，其可造成Rho GTPase等信號通路改變，最終導(dǎo)致足細(xì)胞功能紊亂。此外,1項(xiàng)基于膜性腎病微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明，LRP1作為一個(gè)重要的靶基因，可能參與了膜性腎病的發(fā)病[12]。因此，Crk1/2、CrkL、LRP1與腎臟病之間存在重要聯(lián)系。

c-Jun是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡，它可以形成各種各樣的二聚體，識別AP-1位點(diǎn)和cAMP活化位點(diǎn)，從而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，多種細(xì)胞外刺激對c-Jun的誘導(dǎo)主要是通過ERK、JNK和p38級聯(lián)介導(dǎo)完成[13]。本研究STRING分析發(fā)現(xiàn)，c-Jun與其他已鑒定和預(yù)測的蛋白質(zhì)有最多的相關(guān)連接。KEGG分析顯示，cAMP信號通路和PI3K-Akt信號通路的明顯富集與c-Jun密切相關(guān)，這一結(jié)果表明，c-Jun在接受Crk1/2與CrkL介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)下調(diào)，并通過調(diào)控其他相關(guān)蛋白，在足細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用。

Cdc42EP1是一種Cdc42結(jié)合蛋白，作用于Cdc42下游，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲裝配和板狀偽足的形成，Cdc42EP1主要通過與活化的Cdc42-GTP、RhoQ、aPKC和ERK2相互作用而被調(diào)控[14]。在顱內(nèi)神經(jīng)嵴細(xì)胞中，Cdc42EP1與CRIB結(jié)構(gòu)域相互作用，促進(jìn)偽足突起。Cdc42EP1的缺失會導(dǎo)致細(xì)胞形狀變圓，并伴隨肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)紊亂和黏著斑損傷[15]。本研究的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，Cdc42EP1在Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降的足細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)，提示Crk1/2與CrkL的缺失可以通過抑制Cdc42下游的Cdc42EP1調(diào)節(jié)Rho GTPases，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白纖維結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法探究了Crk1/2與CrkL缺失引起足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，為Crk1/2與CrkL在足細(xì)胞中的功能研究提供了新思路。本研究中，Crk1/2與CrkL單敲降及雙敲降的足細(xì)胞與正常足細(xì)胞相比共有98個(gè)差異蛋白，其中大部分蛋白與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過程相關(guān)。此外，5個(gè)關(guān)鍵蛋白：TPM4、SOD2、LRP1、c-Jun和Cdc42EP1已進(jìn)行Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)它們在足細(xì)胞損傷過程中起關(guān)鍵作用，具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。