王旭，孫妮娜，田岳鳳，翟春濤，單增天，吳愛花

不同灸法對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制兔脾組織程序性死亡因子-1及其配體表達的影響

王旭1，孫妮娜2，田岳鳳2，翟春濤2，單增天2，吳愛花2

1.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619

觀察不同灸法對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制兔脾組織程序性死亡因子-1（PD-1）及其配體PD-L1表達的影響。大耳白兔32只隨機分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組。除空白組外，其余3組腹腔注射環(huán)磷酰胺制備免疫抑制兔模型，連續(xù)7 d。成模后，隔藥餅灸組和艾灸組分別給予隔藥餅灸、艾灸干預(yù)，隔日灸，共灸10次。治療結(jié)束后次日動物麻醉，摘取脾臟。采用RT-qPCR檢測PD-1、PD-L1 mRNA表達，免疫組化檢測PD-1蛋白表達。與空白組比較，模型組兔脾組織PD-1、PD-L1 mRNA表達明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組兔脾組織PD-1、PD-L1 mRNA表達明顯降低（＜0.01），艾灸組兔脾組織PD-L1 mRNA表達明顯降低（＜0.05），PD-1 mRNA表達雖有降低趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，兔脾組織棕褐色PD-1陽性表達主要在細胞漿、細胞膜或間質(zhì)，與空白組比較，模型組兔脾組織PD-1蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組和艾灸組兔脾組織PD-1蛋白表達顯著降低（＜0.01，＜0.05）。不同灸法對免疫抑制兔免疫功能均有明顯改善作用，隔藥餅灸較艾灸更具優(yōu)勢。

灸法；程序性死亡因子-1；程序性死亡因子-1配體；環(huán)磷酰胺；免疫抑制；兔

程序性死亡因子-1（PD-1）及其配體（PD-L1）于1992年由Ishida等[1]提出，最初發(fā)現(xiàn)于凋亡的T細胞雜交瘤，是一種廣泛存在于活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞表面的受體。PD-1是免疫球蛋白B7-CD28家族成員之一，PD-L1為其配體。PD-1作為一種重要的免疫抑制分子，在維持淋巴細胞穩(wěn)態(tài)方面起關(guān)鍵作用。課題組前期研究顯示，不同灸法對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制兔血細胞、免疫球蛋白、補體、免疫細胞、免疫因子及免疫器官均有明顯的調(diào)節(jié)作用，且隔藥餅灸改善上述指標的作用優(yōu)于艾灸[2]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，采用RT-qPCR和免疫組化方法觀察隔藥餅灸、艾灸對免疫抑制兔脾組織共刺激分子PD-1、PD-L1表達的影響，并對兩種灸法的作用進行比較。

1 實驗材料

1.1 動物

大耳白兔40只，體質(zhì)量（2.5±0.3）kg，雌雄各半，北京昌揚西山養(yǎng)殖場提供，動物許可證號SCXK（京）2011-0010。飼養(yǎng)于溫度18～25 ℃、相對濕度50%～70%環(huán)境，自由攝食飲水，分籠飼養(yǎng)7 d。

1.2 艾條、主要試劑和儀器

18 mm×200 mm艾條、艾絨，江蘇盱眙華佗中藥廠。cDNA第一鏈合成試劑盒，立陶宛Fermentas，批號K1622；15596-026Trizol，美國Invitrogen；QPK201Real-time PCR Master Mix（SYBR Green），日本Toyobo；XW-80A渦旋振蕩器，海門其林貝爾；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機，法國Eppendorf；UV-2450紫外光度儀，日本Shimadzu；MultiGene Gradient PCR循環(huán)儀，美國Labnet；DA7600熒光定量PCR循環(huán)儀，中山達安；DYY-6B核酸電泳儀，北京六一；Gel Doc XR凝膠成像儀，美國Bio-Rad； Histocentre 3型石蠟包埋機，英國Shandon；Finesse 325型石蠟切片機，英國Shandon；Excelsior型全自動組織脫水機，英國Shandon；H550L顯微鏡，日本尼康；配套電子顯微鏡DS-Fi3，配套圖像處理軟件NIS-Elements，日本尼康。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

大耳白兔40只隨機分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、艾灸組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除空白組外，其余各組參照文獻[2]方法造模，經(jīng)課題組改良后按60 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號20180802）制備免疫抑制兔模型，即每日上午腹腔注射環(huán)磷酰胺（用生理鹽水稀釋），每日1次，連續(xù)7 d。以動物出現(xiàn)精神狀態(tài)差、飲食少、有脫毛現(xiàn)象及血白細胞計數(shù)明顯降低為造模成功的標志?？瞻捉M每日給予等量生理鹽水腹腔注射。最終以每組8只動物進入統(tǒng)計分析。

2.2 干預(yù)

①穴位選擇：神闕、關(guān)元、足三里（雙）、脾俞（雙）、腎俞（雙），定位參照《實驗針灸學(xué)》[3]常用動物穴位定位法及擬人比照法。②藥餅制作：以六味地黃湯原方比例組方（熟地黃∶山萸肉∶山藥∶澤瀉∶牡丹皮∶茯苓＝8∶4∶4∶3∶3∶3），飲片購自山西同仁堂大藥房，使用時按上述比例打碎成粉末，過120目篩備用，臨用前以溫水調(diào)勻，用模具制成直徑1 cm、厚0.3 cm藥餅。③施灸方法：造模結(jié)束后次日，隔藥餅灸組和艾灸組每日上午施灸治療。動物穴位處剪毛，綁縛固定于兔臺。隔藥餅灸組用艾柱模型將艾絨制成底徑0.8 cm、高0.5 cm大小相等的圓錐形艾柱，置于藥餅上，以線香點燃，燃盡更換，每穴連灸5壯，隔日灸，共灸10次；艾灸組將與5壯艾柱的等量艾絨用卷煙器制作成小艾條，置于自制艾灸架上，在穴位上方約2～3 cm處施灸，隔日灸，共灸10次。④取材：治療結(jié)束后第2日，動物腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘取脾臟，置于生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，稱重；取部分脾臟中段組織置于液氮中，用于RT-qPCR檢測；取部分脾臟中段組織放入10%福爾馬林中固定保存，用于免疫組化觀察。

2.3 指標檢測

2.3.1 實時熒光定量PCR檢測

RNA提取：取適量樣品置于冰冷組織勻漿器中，加入1 mL冰冷的Trizol，冰上研磨至無顆粒狀澄清液，移至1.5 mL離心管，室溫放置5 min；加入氯仿，振蕩15 s，室溫靜置3 min；4 ℃、12 000×離心15 min，取上清液至另一離心管，加入等體積異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min；4 ℃、12 000×離心10 min，棄上清，加75%乙醇1 mL，輕輕混勻。室溫干燥沉淀約5 min，加入30～50 μL無RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后置于-70 ℃冰箱保存。RNA濃度和純度測定：取RNA樣品用1×TE Buffer稀釋樣品100倍，測定260 nm和280 nm處吸光度，確定RNA質(zhì)量，計算RNA濃度，OD260/OD280均在1.8～2.1。cDNA第一鏈合成（20 μL體系）；為減少干擾，每個cDNA樣本稀釋10倍（5 μL cDNA＋45 μL H2O），引物F和R均在同一管中，濃度均為10 μmol/L。兔脾臟分組處理，RT-qPCR檢測樣品基因的表達，實驗重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長度/bp PD1F：CACTGCTGCTGTGCTTGTC146 R：CTGGTGCTCCCTGGTCTACT PD-L1F：TGGATCCAGTCACCTCTGAA138 R：ACTTCTCCTCTCGGTTGGAA GAPDHF：AAGGTCATCCACGACCACTT145 R：AGGCAGGGATGATGTTCTG

2.3.2 免疫組化檢測

取脾臟組織中段2 cm×1 cm×1 cm置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，切片。采用顯微攝像系統(tǒng)進行圖像采集，根據(jù)表達情況及組織大小分別采集5個區(qū)域圖像；應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus6.0測定所采集全部圖像的平均光密度，每張切片采集5張，取其平均值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 不同灸法對模型兔脾組織PD-1 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組兔脾組織PD-1 mRNA表達明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組兔脾組織PD-1 mRNA表達明顯降低（＜0.01），艾灸組兔脾組織PD-1 mRNA表達有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與艾灸組比較，隔藥餅灸組兔脾組織PD-1 mRNA表達有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組兔脾組織PD-1 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

4.2 不同灸法對模型兔脾組織PD-L1 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組兔脾組織PD-L1 mRNA表達明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組和艾灸組兔脾組織PD-L1 mRNA表達明顯降低，（＜0.01，＜0.05）；與艾灸組比較，隔藥餅灸組兔脾組織PD-1 mRNA表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組兔脾組織PD-L1 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

4.3 不同灸法對模型兔脾組織PD-1蛋白表達的影響

免疫組化染色顯示，兔脾組織棕褐色PD-1陽性表達主要在細胞漿、細胞膜或間質(zhì)，見圖1。與空白組比較，模型組兔脾組織PD-1蛋白表達顯著升高，（＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組和艾灸組兔脾組織PD-1蛋白表達明顯降低（＜0.01，＜0.05）；與艾灸組比較，隔藥餅灸組兔脾組織PD-1蛋白表達有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），見表4。

圖1 各組兔脾組織PD-1陽性表達（免疫組化染色，×400）

表4 各組兔脾組織PD-1蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

5 討論

PD-1屬CD28家族分子，為免疫細胞的抑制性共刺激分子，對免疫細胞的功能有著重要的負性調(diào)控作用。PD-1及其配體PD-L1的組織分布特點及所傳遞的抑制信號，在抗原特異性T細胞的活化、增殖及效應(yīng)過程中有重要作用。研究表明，PD-1在T細胞受到刺激后數(shù)小時內(nèi)可表達于激活的T細胞表面，而靜止期的T細胞不表達PD-1[4]。PD-1和PD-L1信號通路具有維持外圍正常免疫效應(yīng)的作用，PD-1以不同的親和力與其配體PD-L1和PD-L2結(jié)合。

中醫(yī)藥調(diào)節(jié)機體免疫功能具有整體性、平衡性、多系統(tǒng)和多靶點特點，可改善機體內(nèi)環(huán)境，使機體處于陰陽平衡狀態(tài)。隔藥餅灸是集藥物、穴位、艾灸三者作用為一體的一種獨特艾灸治療方法，它借助艾絨易于燃燒，火力溫和，熱力具有穿透皮膚、直達組織深部的特點，使所隔藥物透皮吸收，減少對胃腸道的刺激。本研究所用藥物為經(jīng)方六味地黃湯，方中熟地黃滋補肝腎、益精填髓，山萸肉補益肝腎，山藥補脾益腎，三藥配合，肝、脾、腎三陰并補，以補肝腎為主；茯苓健脾燥濕、利水滲濕，澤瀉利濕泄?jié)?，牡丹皮清泄虛熱，三藥配合瀉肝脾腎。全方有開合之妙，補中有瀉、瀉中有補，補而不膩，瀉不傷正。研究表明，六味地黃湯組成藥物及成方均含有提高或調(diào)節(jié)機體免疫功能的活性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)機體的免疫功能[5]。

在穴位選擇上，本研究選用脾俞、腎俞、神闕、足三里、關(guān)元，均為傳統(tǒng)保健要穴。脾俞和腎俞為背俞穴，具有調(diào)補脾腎之氣之功，二穴同用可補腎滋陰、健脾益氣，增強先后天之本。足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，是強身保健、延年益壽的要穴。神闕屬任脈，為真氣所承，是“五臟六腑之本，沖脈循行之地，元氣歸藏之根”，具有養(yǎng)生保健、延年益壽、溫補元陽、健運脾胃、復(fù)蘇固脫之功效。關(guān)元為足三陰經(jīng)、任脈之會，小腸之募穴，為先天之原氣與元陰元陽交關(guān)之所，有溫腎固精、補氣回陽、通調(diào)沖任、理氣和血之功效。本實驗結(jié)果顯示，艾灸“關(guān)元”“足三里”“脾俞”等穴可改善胃腫瘤大鼠一般狀況和荷瘤生存狀態(tài)，明顯提高荷瘤大鼠胸腺、脾臟指數(shù)及外周血CD3-CD161+NK和CD3+CD161+NKT含量，改善大鼠生存狀態(tài)，其調(diào)控機制與強化機體非特異性抗腫瘤免疫相關(guān)[6]。艾灸“腎俞”“足三里”可通過降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清白細胞介素-6含量，抑制免疫細胞分化產(chǎn)生相關(guān)炎癥因子，控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[7]。不同灸量隔藥餅灸“脾俞”“腎俞”“足三里”“關(guān)元”“神闕”可改善環(huán)磷酰胺所致兔免疫功能低下，且不同灸量效果有一定差異[8]。臨床研究表明，化膿灸足三里治療中晚期結(jié)腸癌患者，可通過調(diào)節(jié)外周血T細胞亞群中CD4+、CD8+含量，降低血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1水平，提高機體的免疫功能，從而提高其生活質(zhì)量[9]。艾灸腎俞、關(guān)元治療可通過改善運動員紅細胞免疫功能和T細胞亞群功能異常，提高其機體免疫力[10]。

PD-1及其配體作為近年研究體內(nèi)免疫反應(yīng)重要分子的負性調(diào)節(jié)因子，其信號通路可誘導(dǎo)和維持外周組織的免疫耐受，對防止組織的過度炎癥反應(yīng)以及自身免疫性疾病的發(fā)生具有積極作用。研究發(fā)現(xiàn)，采用腹腔注射環(huán)磷酰胺制備免疫抑制小鼠模型，其PD-1 mRNA處于高表達狀態(tài)，給予云芝多糖肽治療后PD-1 mRNA表達顯著降低，表明云芝糖肽可能通過下調(diào)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠脾臟組織免疫負調(diào)控分子PD-1 mRNA表達而發(fā)揮免疫增強作用[11]。還有研究用黃芪、金銀花、野菊花、鬼針草、半枝蓮組成中藥復(fù)方提取液，采用RT-PCR檢測脾臟PD-1/PD-L1的表達，隨著中藥提取液濃度的增加，脾臟淋巴細胞PD-1表達顯著降低，而PD-L1 mRNA表達無顯著變化，表明中藥復(fù)方能抑制淋巴細胞PD-1的表達[12]。此外，有研究表明，黃芪提取物黃芪多糖能抑制荷瘤小鼠脾組織PD-1 mRNA的表達，而PD-L1 mRNA表達無顯著變化[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，空白組兔脾組織PD-1、PD-L1 mRNA呈低水平表達，注射環(huán)磷酰胺造成免疫抑制模型后，均表現(xiàn)出高表達；經(jīng)干預(yù)后，隔藥餅灸組較模型組PD-1、PD-L1 mRNA表達均明顯降低；艾灸組PD-1 mRNA表達與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，PD-L1 mRNA表達較模型組差異顯著。作為配體的PD-L1 mRNA的表達較PD-1 mRNA的表達顯著，可能與T細胞的免疫活化有關(guān)。

PD-1屬免疫球蛋白超家族成員，其以單體形式存在于細胞表面，正常人淋巴組織生發(fā)中心中T淋巴細胞表面可檢測到PD-1的表達，PD-L1通常表達于腫瘤細胞表面，也表達在T細胞和B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間充質(zhì)干細胞和骨髓來源的肥大細胞等。劉敏龍等[14]通過觀察膿毒癥小鼠脾臟PD-L1表達，發(fā)現(xiàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔法造模小鼠脾臟PD-L1陽性細胞出現(xiàn)在紅髓和脾小體，且24 h和48 h單核細胞PD-L1的表達均較假手術(shù)組升高，表明膿毒癥小鼠脾臟PD-L1表達可能參與膿毒癥發(fā)生發(fā)展。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PD-1和PD-L1鼻咽癌及鼻咽部正常黏膜組織中均有表達，但在鼻咽癌組織中的表達均異常升高，高于正常組織；PD-1陽性表達主要位于細胞核和/或細胞漿中，與患者年齡、性別、病理類型、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與吸煙有關(guān)；PD-L1主要表達場所位于細胞漿中，與患者性別、吸煙、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與年齡及分期有關(guān)[15]。研究還發(fā)現(xiàn)，PD-1在食管癌患者正常組織中均未見表達，PD-1和PD-L1在癌組織和癌旁組織中均呈陽性表達，且有遠處轉(zhuǎn)移的食管癌PD-L1高表達率明顯高于無遠處轉(zhuǎn)移的食管癌[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，急性腎移植排斥腎組織PD-1/PD-L1的表達，急性腎移植排斥腎組織PD-L1、PD-1較正常組增多、增強，其小管PD-L1陽性強度與腎間質(zhì)PD-1陽性細胞數(shù)呈正相關(guān)，與小管間質(zhì)病理損害程度呈負相關(guān)，表明PD-L1/PD-1信號通路在急性腎移植排斥腎小管間質(zhì)病理損害中起重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示，兔脾組織棕褐色PD-1陽性表達主要在細胞漿、細胞膜或間質(zhì)，且模型組兔脾組織PD-1蛋白表達較空白組顯著升高；經(jīng)干預(yù)后，隔藥餅灸組和艾灸組兔脾組織蛋白表達均明顯降低，但隔藥餅組與艾灸組蛋白表達比較差異不明顯。

綜上，兔脾組織棕褐色PD-1陽性表達主要在細胞漿、細胞膜或間質(zhì)，隔藥餅灸和艾灸均可降低兔脾組織PD-1蛋白表達。隔藥餅灸可降低脾組織PD-1、PD-L1 mRNA表達，而艾灸雖能抑制PD-1、PD-L1 mRNA的表達，但對PD-1 mRNA的表達抑制程度不明顯?？梢姡煌姆▽γ庖咭种仆妹庖吖δ芫忻黠@的改善作用，隔藥餅灸較艾灸更具優(yōu)勢。此項觀察是基于前期不同灸法對機體免疫功能調(diào)節(jié)作用研究開展的，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上圍繞PD-1及PD-L1通路對T細胞、B細胞的免疫活化、免疫耐受等進行更深層次的研究。

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Effects of Different Types of Moxibustion on Expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA in Immunosuppressive Rabbits Induced by Cyclophosphamide

WANG Xu1, SUN Nina2, TIAN Yuefeng2, ZHAI Chuntao2, SHAN Zengtian2, WU Aihua2

To observe the changes of expressions of PD-1 and PD-L1 in immunosuppressive rabbits induced by cyclophosphamide through different types of moxibustion.Totally thirty-two rabbits were randomly divided into blank group, model group, herbal cake-separated moxibustion group and moxibustion group. Except the blank group, the other three groups were intraperitoneally injected with cyclophosphamide to make immunosuppressive rabbit model for 7 days. After the model was established, herbal cake-separated moxibustion group and moxibustion group were treated with herbal cake-separated moxibustion and directed-moxibustion respectively, once every other day, 10 times in total. The next day after the treatment, the animals were anesthetized and the spleen was removed. The expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and the expression of PD-1 protein was detected by immunohistochemistry.Compared with the blank group, the expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA in the spleen tissue of the model group increased significantly (<0.01). Compared with the model group, the expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA in the spleen tissue of the rabbits in the herbal cake-separated moxibustion group was significantly lower (<0.01), and the expression of PD-L1 mRNA in the spleen tissue of the moxibustion group was significantly lower (<0.05), while the PD-1 mRNA showed a decreasing trend, without statistical significance (>0.05). Immunohistochemical results showed that the positive expression of PD-1 in rabbit spleen tissue was mainly in the cytoplasm, cell membrane or interstitial. Compared with the blank group, the expression of PD-1 protein in the rabbit spleen tissue of the model group significantly increased (<0.01). Compared with the model group, the expression of PD-1 protein in the spleen tissues of rabbits in the herbal cake-separated moxibustion group and moxibustion group was significantly reduced (<0.01,<0.05).Different types of moxibustion have obviously improved the immune function of immunosuppressive rabbits, and herbal cake-separated moxibustion has more advantages than moxa moxibustion.

moxibustion; PD-1; PD-L1; cyclophosphamide; immunosuppressive; rabbits

R245

A

1005-5304(2020)11-0066-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202007162

國家自然科學(xué)基金（81674062）

田岳鳳，E-mail：tyfsx@163.com

（2020-07-09）

（2020-07-29；編輯：華強）