顧志榮，孫嵐萍，錢倩，吳國泰，石磊，許愛霞，葛斌

不同產(chǎn)地鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜及含量測定研究

顧志榮1，孫嵐萍2，錢倩1，吳國泰3，石磊1，許愛霞1，葛斌1

1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

建立12個產(chǎn)地鎖陽水溶性部位的HPLC指紋圖譜、3種成分同時測定及主成分分析（PCA）評價方法。采集5個?。▍^(qū)）12個市（區(qū)/州/旗）的95批鎖陽，提取水溶性部位。采用WondaSil C18-WR色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以甲醇-0.1%甲酸水溶液（9∶91）為流動相，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長258 nm，進(jìn)樣量10 μL，建立HPLC指紋圖譜及沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素含量測定方法。對12個產(chǎn)地鎖陽水溶性部位的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，以指紋圖譜共有峰峰面積為變量建立PCA模型，進(jìn)行質(zhì)量評價與產(chǎn)區(qū)鑒別，采用載荷分析尋找不同產(chǎn)區(qū)樣品共有峰差異。12個產(chǎn)地鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜的主要色譜峰一致，共指認(rèn)出16個共有峰，除阿拉善左旗、阿拉善右旗、和田樣品外，其余產(chǎn)地樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.9。沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素分別在0.022～0.330、0.002～0.030、0.080～1.200 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8、0.999 3、0.999 4，平均加樣回收率分別為100.54%、99.82%、99.62%，RSD分別為1.71%、1.95%、2.07%。鎖陽水溶性部位沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素含量分別為0.031 3～7.031 6、0.025 5～0.396 3、0.003 5～0.793 4 mg/g。PCA可將鎖陽樣品按12個市級產(chǎn)區(qū)、5個省級產(chǎn)區(qū)進(jìn)行質(zhì)量評價與歸類分析，載荷分析篩選出導(dǎo)致不同產(chǎn)地鎖陽水溶性部位整體質(zhì)量差異的5個化學(xué)成分。本研究建立的分析方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，可用于不同產(chǎn)地鎖陽的綜合質(zhì)量評價及產(chǎn)區(qū)鑒別。

鎖陽；水溶性部位；高效液相色譜法；指紋圖譜；同時測定；主成分分析

鎖陽為鎖陽科植物鎖陽Rupr.的干燥肉質(zhì)莖，是一種寄生于蒺藜科白刺屬植物根部的沙生藥材，功效補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便[1]。鎖陽含有黃酮類、三萜類、多酚類、有機(jī)酸類、多糖類、鞣質(zhì)及多種人體必需氨基酸[2]，具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、抑制前列腺增生[5]、抑制骨吸收[6]、保護(hù)神經(jīng)損傷[7]、增強(qiáng)性功能[8]、抗骨質(zhì)疏松[9]等藥理作用。近年來，鎖陽的功能保健食品發(fā)展亦備受關(guān)注，如鎖陽油餅、鎖陽茶、鎖陽酒、鎖陽咖啡等。鎖陽主要分布于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、青海、寧夏等地區(qū)的沙漠和半沙漠地帶，產(chǎn)地分布遼闊、東西跨度大，生態(tài)因子差異明顯[10]。不同的生態(tài)因子會影響藥用植物的物候規(guī)律、生長發(fā)育、物質(zhì)合成、能量代謝等生理作用，從而通過影響次生代謝產(chǎn)物（有效物質(zhì)）而導(dǎo)致藥材質(zhì)量及臨床療效產(chǎn)生差異[11]。

迄今，鎖陽均為野生品，但其生長環(huán)境惡劣，資源儲量小，加之具有突出的補(bǔ)益及功能保健作用，導(dǎo)致市售鎖陽存在摻雜、混用、亂用等現(xiàn)象。另外，2015年版《中華人民共和國藥典》鎖陽僅以醇溶性浸出物為質(zhì)控成分[1]，無其他有效成分、指標(biāo)成分或有效部位的含量測定，因此其內(nèi)在質(zhì)量評價與質(zhì)量控制是目前存在的難題之一。本研究基于多產(chǎn)地、大樣本建立鎖陽水溶性部位的HPLC指紋圖譜及3種有效成分的同時測定方法，建立主成分分析（PCA）模型進(jìn)行綜合質(zhì)量評價與產(chǎn)區(qū)鑒別，尋找不同產(chǎn)區(qū)鎖陽的指紋圖譜差異峰，為其物質(zhì)基礎(chǔ)研究與質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-16型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司，配置SIL-16型自動進(jìn)樣器、SPD-16型檢測器、CTO-16型柱溫箱、LabSolutions化學(xué)工作站），AL204型1/1萬電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），DZF-6090型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

對照品沒食子酸（批號CHB171107，含量≥98%）、原兒茶酸（批號CHB170822，含量≥98%）、兒茶素（批號CHB170313，含量≥98%），成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。95批鎖陽樣品，采集于甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、青海、寧夏5個?。ㄗ灾螀^(qū)）的12個市（地區(qū)/州/旗），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為Rupr.的干燥肉質(zhì)莖，見表1。將樣品曬至干透，粉碎，過80目篩，冷藏備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用WondaSil C18-WR色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（9∶91），流速0.8 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃，檢測波長258 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對照品溶液制備

分別精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素對照品適量，以純化水超聲使完全溶解，制成濃度分別為0.11、0.01、0.40 mg/mL的混合對照品溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液制備

取樣品粉末約2.0 g，精密加入純化水10 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

表1 95批不同產(chǎn)地鎖陽樣品信息

產(chǎn)地批次編號海拔/m 氣候類型 甘肅省張掖市肅南縣（ZY）8 1～81475～3154溫帶大陸性氣候 甘肅省酒泉市瓜州縣（JQ）12 9～201063～1590溫帶大陸性氣候 甘肅省酒泉市金塔縣（JQ）921～291233～1421溫帶大陸性荒漠氣候 甘肅省酒泉市敦煌市（DH）730～36 958～1815暖溫帶干旱性氣候 甘肅省武威市民勤縣（WW）737～431293～1545溫帶大陸性干旱氣候 內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗（AZ）1044～53 789～1541中溫帶大陸性氣候 內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善右旗（AY）654～591299～1503溫帶大陸性氣候 寧夏石嘴山市平羅縣（SZS）560～641103～1247溫帶大陸性氣候 新疆喀什地區(qū)喀什市疏附縣（KS）565～691229～1312暖溫帶大陸性干旱氣候 新疆阿勒泰地區(qū)阿勒泰市（ALT）970～78 813～1003溫帶大陸性氣候 新疆和田地區(qū)和田縣（HT）879～862875～3436溫帶極端干旱荒漠氣候 青海省海南藏族自治州同德縣（HN）587～912926～3266高原大陸性氣候 青海省海西蒙古族藏族自治州格爾木戈壁灘（HX）492～952815～2833荒漠、半荒漠大陸性氣候

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 空白溶劑考察

取純化水，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果表明溶劑無干擾。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取樣品（1號）供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以12號峰為參比峰，16個共有峰的相對保留時間RSD為0.02%～2.11%，相對峰面積RSD為0.00%～2.23%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品（1號）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以12號峰為參比峰，16個共有峰的相對保留時間RSD為0.01%～1.97%，相對峰面積RSD為0.02%～2.75%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（1號）供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以12號峰為參比峰，16個共有峰的相對保留時間RSD為0.00%～2.03%，相對峰面積RSD為0.00%～2.76%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜建立

利用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）建立指紋圖譜及對照圖譜[12]，見圖1、圖2。共指認(rèn)16個共有峰，通過比對紫外吸收圖及對照品色譜圖，確定了沒食子酸（1號峰，＝4.193 min）、原兒茶酸（6號峰，＝7.744 min）、兒茶素（14號峰，＝17.063 min）3個成分。12號峰與相鄰峰的分離度好、峰面積較大、較穩(wěn)定，故作為參比峰，16個共有峰相對保留時間RSD為0.01%～2.27%。

圖1 95批鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜

注：A.混合對照品；B.供試品；1.沒食子酸；6.原兒茶酸；14.兒茶素

2.6 指紋圖譜相似度評價

求取12個產(chǎn)地鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜的共有模式（見圖3），以相關(guān)系數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行相似度評價[13]，結(jié)果見表2。12個產(chǎn)地樣品指紋圖譜的主要色譜峰一致，但局部可見細(xì)微差別；除阿拉善左旗、阿拉善右旗、和田樣品外，其余產(chǎn)地樣品與對照圖譜的相似度均大于0.9。

從12個產(chǎn)地鎖陽指紋圖譜相似度可以看出，甘肅4個產(chǎn)區(qū)武威、酒泉、敦煌、張掖樣品的相似性較高（0.944～0.992），但與阿拉善左旗、喀什、和田樣品相似性較低（0.892～0.925）；阿拉善右旗、阿拉善左旗及石嘴山樣品的相似性較高（0.929～0.953），但與喀什、阿勒泰、和田、海西、海南樣品的相似度較低（0.857～0.913）；新疆的3個產(chǎn)區(qū)喀什、和田及阿勒泰樣品的相似性較高（0.925～0.954），但與其他產(chǎn)區(qū)樣品的相似度均較低；青海海西、海南樣品與甘肅4個產(chǎn)區(qū)的樣品相似性較高。

圖3 12個產(chǎn)地鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜共有模式

表2 12個產(chǎn)地鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜相似度評價結(jié)果（r）

產(chǎn)地ZYJQDHWWAZAYSZSKSALTHTHNHXR ZY1.000 JQ0.9751.000 DH0.9890.9921.000 WW0.9790.9570.9441.000 AZ0.9230.8950.9120.9251.000 AY0.9100.9060.8920.8970.9531.000 SZS0.9110.8960.9010.9160.9290.9411.000 KS0.8920.9080.8930.9170.9130.9040.8961.000 ALT0.9050.9320.9230.8960.8740.8760.8920.9541.000 HT0.8990.9050.8950.8890.8820.8570.8630.9430.9251.000 HN0.9050.8960.8840.9120.9010.9070.9120.8920.9030.9071.000 HX0.9110.8970.9220.9040.8980.9120.8890.8860.9020.9080.9641.000 R0.9370.9060.9150.9170.8990.8970.9040.9210.9140.8930.9180.9091.000

2.7 沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素含量測定

2.7.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果理論塔板數(shù)以沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素計(jì)算均大于3000，3種成分的色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對稱因子為0.95～1.05，樣品中其他成分不干擾待測成分的測定。

2.7.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，以純化水定容至刻度，搖勻，得系列對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以各對照品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表3?？芍?，沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 3種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

成分回歸方程相關(guān)系數(shù)線性范圍/μg 沒食子酸Y＝993 773 573X－20 234.850.999 80.022～0.330 原兒茶酸Y＝1 348 134 048X－54 635.900.999 30.002～0.030 兒茶素Y＝21 261 314.39X－20 584.790.999 40.080～1.200

2.7.3 精密度試驗(yàn)

取同一樣品（1號）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素峰面積RSD分別為0.66%、1.53%、1.07%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（1號）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素峰面積RSD分別為0.92%、1.19%、0.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品（1號）6份，以“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算得沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素峰面積的RSD分別為1.95%、2.18%、2.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（1號）約2 g，共9份，精密稱定，按低、中、高3個水平，分別以待測成分含量的0.8、1.0、1.2倍精密加入混合對照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定并計(jì)算回收率。結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素的平均加樣回收率分別為100.54%、99.82%、99.62%，RSD分別為1.71%、1.95%、2.07%，表明該方法回收率良好，見表4。

表4 3種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

成分取樣量 /g樣品中 含量/mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回 收率/%RSD /% 沒食子酸2.000 42.834 22.260 35.136 5101.86100.541.71 2.000 82.837 02.260 35.144 3102.08 1.999 52.835 12.260 35.044 1 97.73 2.001 12.838 62.825 45.682 4100.65 2.000 22.833 72.825 45.613 3 98.38 2.000 62.832 12.825 45.653 0 99.84 2.000 92.836 33.390 56.233 2100.19 1.998 72.832 23.390 56.323 1102.96 2.000 82.831 33.390 56.261 1101.16 原兒茶酸2.001 30.473 10.377 20.850 1 99.96 99.821.95 2.000 90.470 50.377 20.844 7 99.21 1.998 30.472 90.377 20.860 1102.64 2.001 20.472 10.471 40.934 4 98.07 2.000 30.470 50.471 40.950 9101.91 2.001 60.471 60.471 40.935 4 98.39 2.001 00.470 40.565 41.021 6 97.48 1.998 60.473 60.565 41.031 0 98.59 2.001 20.473 20.565 41.050 8102.16 兒茶素2.001 20.488 70.391 40.885 1101.28 99.622.07 2.001 70.483 50.391 40.868 6 98.40 1.999 50.484 40.391 40.875 8100.02 2.001 20.484 80.489 30.982 7101.76 2.000 30.483 50.489 30.959 5 97.28 2.000 70.485 80.489 30.958 8 96.67 2.001 30.485 30.587 01.068 6 99.37 2.001 60.486 50.587 01.067 5 98.99 2.000 80.480 10.587 01.083 8102.84

2.8 樣品測定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各樣品中沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5?？芍?，鎖陽水溶性部位中沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素含量分別為0.031 3～7.031 6、0.025 5～0.396 3、0.003 5～0.793 4 mg/g。

2.9 主成分分析

以指紋圖譜共有模式的16個共有峰峰面積為變量，采用PCA對12個市級產(chǎn)區(qū)的95批鎖陽進(jìn)行分析[14]。結(jié)果表明，前2個主成分的累積貢獻(xiàn)率為87.385%，能夠反映整體變量的主要特征，其中第一主成分貢獻(xiàn)率為61.745%。PCA得分圖見圖4。整體來看，除9批樣品離群外，86批鎖陽樣品在PCA得分圖中可被明顯區(qū)分為11個區(qū)域。除青海省海西、海南2個市級產(chǎn)區(qū)未能分開外，其他10個市級產(chǎn)區(qū)均能被明顯區(qū)分，而青海省所產(chǎn)鎖陽在省級區(qū)域亦可與其他產(chǎn)地明顯區(qū)分開，說明不同省級、市級產(chǎn)區(qū)鎖陽在化學(xué)成分方面具有一定差異性。

從省級產(chǎn)區(qū)來看，鎖陽在PCA得分圖中體現(xiàn)了較為明顯的地域性分布特征，甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、青海、寧夏5個省區(qū)樣品可完全區(qū)分開，表明不同省級產(chǎn)區(qū)鎖陽水溶性部位在化學(xué)成分方面的差異性更為明顯。除離群樣本外，內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)鎖陽位于PCA得分圖的第1象限，寧夏產(chǎn)區(qū)鎖陽位于第2象限，新疆產(chǎn)區(qū)鎖陽位于第3象限，甘肅、青海產(chǎn)區(qū)鎖陽位于第4象限。PCA得分＝第一主成分（[1]）×[1]的貢獻(xiàn)率＋第二主成分（[2]）×[2]的貢獻(xiàn)率，是對共有峰峰面積大小的綜合評價，因此是鎖陽質(zhì)量的直接體現(xiàn)。第1象限鎖陽樣品[1]、[2]均大于0，因此PCA得分最大，均大于0；第2象限樣品[1]＜0，[2]＞0，而[1]的貢獻(xiàn)率為61.745%，[2]的貢獻(xiàn)率為25.639%，因此PCA得分＜0；第3象限樣品[1]、[2]均小于0，因此PCA得分最小，均小于0；第4象限樣品[1]＞0，[2]＜0，因此PCA得分＞0。綜上可知，內(nèi)蒙古鎖陽樣品PCA得分最高、質(zhì)量最佳，其次為甘肅、青海樣品，最后為寧夏、新疆樣品。

采用載荷分析進(jìn)一步探討不產(chǎn)區(qū)鎖陽的共有峰差異[15]，見圖5，變量重要性投影（VIP）見圖6。載荷圖中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的變量分別為共有峰1、6、11、14、16，而VIP＞1的變量依次為14、11、6、16、1，說明共有峰14（兒茶素）、11、6（原兒茶酸）、16、1（沒食子酸）是不同產(chǎn)區(qū)鎖陽水溶性部位的差異共有峰，是對不同產(chǎn)區(qū)鎖陽整體質(zhì)量有主要影響的化學(xué)成分，可作為鎖陽藥材的質(zhì)量標(biāo)志物。

表5 95批鎖陽樣品水溶性部位3種成分含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）

編號沒食子酸原兒茶酸兒茶素 編號沒食子酸原兒茶酸兒茶素 編號沒食子酸原兒茶酸兒茶素 編號沒食子酸原兒茶酸兒茶素 11.416 80.235 00.244 4 250.322 20.058 40.510 0 493.156 00.049 90.513 6 731.201 30.199 80.063 7 21.179 40.048 60.341 0 260.676 40.069 70.793 4 501.694 70.046 90.423 1 740.300 20.068 20.068 6 33.625 60.045 30.254 8 270.442 90.074 50.518 1 512.292 70.044 60.503 1 751.340 70.112 20.095 0 41.676 70.240 90.147 2 280.882 10.124 10.182 5 521.904 60.044 40.397 6 760.677 60.059 90.044 6 50.732 10.119 10.122 2 290.988 30.205 20.151 2 531.879 80.038 60.546 8 770.654 50.362 80.083 5 60.438 80.159 80.198 1 300.957 40.155 40.223 8 540.492 50.068 10.207 2 780.115 60.076 70.088 6 71.135 00.085 70.577 5 310.918 50.087 70.254 7 550.776 90.072 90.234 6 792.034 50.190 10.167 9 80.351 20.077 40.373 2 321.217 40.089 50.303 8 560.705 20.061 80.219 0 800.862 10.188 90.179 4 90.031 30.086 90.225 1 330.601 30.079 70.236 1 570.962 50.074 60.203 0 810.832 50.182 90.172 1 101.327 10.095 60.417 1 341.103 80.289 10.379 9 580.600 20.080 40.182 8 820.918 00.193 00.193 7 110.394 30.122 10.293 8 351.608 50.396 30.444 8 590.962 40.071 40.181 6 834.430 70.111 00.140 4 120.628 40.351 70.281 4 361.251 20.122 90.420 3 600.376 80.176 80.021 0 843.925 20.112 50.126 7 132.863 80.116 40.157 9 370.121 10.240 90.052 6 610.387 70.190 10.025 9 857.031 60.111 70.086 5 140.776 30.294 60.186 4 380.589 00.082 70.337 4 620.151 40.065 60.043 4 861.150 80.186 20.204 3 150.378 80.179 30.134 3 390.639 70.072 20.500 1 630.599 80.101 20.188 4 870.592 00.086 00.234 0 160.389 00.131 50.200 8 400.483 90.089 60.428 7 640.410 30.185 10.052 8 880.563 80.078 70.222 5 170.674 50.081 90.168 0 410.196 20.074 20.474 8 651.571 50.340 60.103 6 890.550 00.075 90.217 4 180.469 00.093 10.040 8 421.085 10.076 00.444 8 660.730 30.326 90.056 3 900.588 10.080 00.227 4 190.611 00.272 40.298 0 431.208 00.069 50.629 4 670.514 90.231 30.059 7 910.273 10.062 70.102 5 200.167 50.256 80.038 0 442.152 90.058 60.388 2 680.459 30.190 40.054 1 920.314 50.100 30.003 5 210.722 40.206 80.327 5 455.032 60.077 50.434 0 690.473 70.192 10.066 6 930.140 40.054 10.030 2 222.680 40.057 60.310 4 462.043 50.077 20.515 6 701.315 60.149 80.155 7 941.209 00.025 50.228 7 230.819 80.111 70.351 4 470.621 40.077 70.343 6 710.788 40.143 80.028 1 950.234 60.033 40.046 8 241.143 50.102 00.136 6 480.737 70.086 20.309 1 720.568 40.130 20.077 0

圖4 12個市級產(chǎn)區(qū)鎖陽樣品PCA得分圖

圖5 鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜共有峰主成分載荷圖

圖6 鎖陽水溶性部位HPLC指紋圖譜共有峰VIP分析

3 討論

本試驗(yàn)對提取溶劑（不同濃度甲醇、不同濃度乙醇及水）、提取方法（不同條件超聲及熱回流法）、流動相（乙腈-水、乙腈-甲酸水、甲醇-水及甲醇-甲酸水）及其初始比例、等度洗脫與梯度洗脫、檢測波長及柱溫等進(jìn)行考察，優(yōu)選出了最佳條件。其中，以水超聲提取所得水溶性部位的色譜圖基線平、出峰多、分離效果好，因此對鎖陽成分采取水部位研究是較好的選擇。對比等度洗脫與梯度洗脫發(fā)現(xiàn)，采用梯度洗脫出峰雖比等度洗脫多，但當(dāng)有機(jī)相比例為25%～75%時基線漂移嚴(yán)重，峰形及分離度均不如等度洗脫，且兒茶素難以達(dá)到基線分離，因此最終選擇等度洗脫進(jìn)行色譜分離。

除小部分樣品歸類錯誤及離群外，PCA能將鎖陽藥材按照5個省級產(chǎn)區(qū)、12個市級產(chǎn)區(qū)進(jìn)行歸類，表明PCA適用于鎖陽藥材的產(chǎn)地鑒別。由PCA得分圖可知，地理位置相鄰或相近的產(chǎn)區(qū)鎖陽樣品被聚類在一起，且與地理位置相距較遠(yuǎn)的產(chǎn)區(qū)樣品較好地分離，表明不同市級、省級產(chǎn)區(qū)鎖陽在化學(xué)成分方面具有差異性。不同市級產(chǎn)區(qū)鎖陽可通過PCA歸屬于其所在省級產(chǎn)區(qū)中，表明鎖陽的內(nèi)在質(zhì)量體現(xiàn)了明顯的地域性聚集特征。這是由于地理位置互相靠近的產(chǎn)區(qū)具有更為相近的環(huán)境因子，進(jìn)一步印證了產(chǎn)地環(huán)境因子是鎖陽藥材品質(zhì)及道地性形成的主導(dǎo)因素。

載荷分析發(fā)現(xiàn)，共有峰14（兒茶素）、11、6（原兒茶酸）、16、1（沒食子酸）是不同產(chǎn)地鎖陽樣品的差異共有峰，是對不同產(chǎn)地鎖陽整體質(zhì)量產(chǎn)生主要影響的化學(xué)成分。因此，本研究選擇兒茶素、原兒茶酸、沒食子酸作為鎖陽藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)具有一定合理性，對高效控制鎖陽藥材質(zhì)量具有一定指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)采集樣品涉及產(chǎn)地多、分布區(qū)域廣、樣本量大，增強(qiáng)了研究的代表性與說服力，有利于更全面掌握鎖陽藥材的資源分布，進(jìn)行更為科學(xué)的綜合質(zhì)量評價。

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Study on HPLC Fingerprints and Content Determination of Water Fraction of Cynomorii Herba from Different Producing Areas

GU Zhirong1, SUN Lanping2, QIAN Qian1, WU Guotai3, SHI Lei1, XU Aixia1, GE Bin1

To establish HPLC fingerprints and simultaneous determination of 3 components and quality evaluation methodsof water fraction of Cynomorii Herba from 12 producing areas based on principal component analysis (PCA).Totally 95 batches of Cynomorii Herba from 12 cities in 5 provinces were collected and water fractions were extracted. HPLC fingerprints and simultaneous determination method of gallic acid, protocatechuic acid and catechin were achieved on WondaSil C18-WR column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm), with methanol-0.1% formic acid solution (9:91) as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.8 mL/min; column temperature was 30 ℃; detection wavelength was 258 nm; injection volume was 10 μL. Fingerprints of water fraction of Cynomorii Herba from 12 producing areas were analyzed for similarity. Taking common peak areas of fingerprints as variables, PCA models were established for quality evaluation and identification of different producing areas. Loading analysis was used to find differences in common peaks of samples from different producing areas.The main peaks of HPLC fingerprints of water fraction of Cynomorii Herba from 12 producing areas were consistent, and 16 common peaks were identified. Except for Alxa Left Banner, Alxa Right Banner and Hetian City, the fingerprint similarities of samples between other producing areas and control fingerprint were greater than 0.9. The gallic acid, protocatechuic acid and catechin showed good linearity relationships within the ranges of 0.022–0.330, 0.002–0.030, and 0.080–1.200 μg; their correlation coefficients were 0.999 8, 0.999 3 and 0.999 4; their average recoveries were 100.54%, 99.82% and 99.62%, with RSD of 1.71%, 1.95% and 2.07%, respectively. The contents of gallic acid, protocatechuic acid and catechin of water fraction of Cynomorii Herba were 0.031 3–7.031 6, 0.025 5–0.396 3, and 0.003 5–0.793 4 mg/g, respectively. The established PCA model could realize quality evaluation and classification of Cynomorii Herba in accordance with 12 city producing areas and 5 provincial producing areas. The loading analysis screened out 5 chemical components that caused differences in the overall quality of Cynomorii Herba from different producing areas.The established analytical method is stable, accurate and reliable, which can be used for comprehensive quality evaluation and identification of producing areas of Cynomorii Herba in different producing areas.

Cynomorii Herba; water fraction; HPLC; fingerprints; simultaneous determination; principal component analysis

R284.1

A

1005-5304(2020)11-0082-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202003444

甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（ZDSYS-KJ-2018-010）；甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（ZYZL18-004）；甘肅省人民醫(yī)院研發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目（18GSSY2-3）

葛斌，E-mail：gjy0630@163.com

（2020-03-16）

（2020-04-07；編輯：陳靜）