張知俠，高奕紅

(咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 咸陽 712000)

野菊花為多年生草本植物,多生長于路邊、山坡草地、荒野以及小樹林等野生地帶,為菊科菊屬植物野菊(ChrysanthemumindicumLamb)的干燥頭狀花序。野菊花是一味中藥，其全草皆可入藥，在中國各地均有分布，盛產(chǎn)于云南、四川等地區(qū)；野菊花性苦、辛涼，主要用于治療腫毒瘡癰，疏風(fēng)散熱，多用于上呼吸道感染、流行性感冒的治療，還有降血壓，瀉火平肝等作用。野菊花的生物活性多樣，其成分中以精油、黃酮類、多糖、二萜類為主；現(xiàn)代藥理研究表明，野菊花提取物有較強(qiáng)的抗氧化能力、抗骨質(zhì)疏松[1-2]，可降血糖、降血脂[3-4]，鎮(zhèn)痛消炎[5-7],還具有一定的抗抑郁作用[8-9]，在抗癌方面的研究也有新進(jìn)展，野菊花提取物具有抗前列腺癌[10]，抗肝癌的作用[11]；其精油具有廣譜抗菌活性，能有效抑制白色念球菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌、白喉?xiàng)U菌及大腸桿菌等細(xì)菌[12]。在植物保護(hù)方面的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)野菊花精油對(duì)植物病原菌煙草黑脛病菌[13]、蕎麥立枯絲核菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性[14]。實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)自陜西咸陽本地的野菊花精油的化學(xué)成分及其抑菌活性進(jìn)行研究，以期為有效開發(fā)野菊花資源，充分挖掘野菊花精油作為農(nóng)藥的有效成分，為開發(fā)天然產(chǎn)物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

野菊花：采于陜西咸陽郊區(qū)山坡上，用其頭狀花序，經(jīng)篩選干燥后粉碎過450 μm篩，置于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；辣椒疫霉病菌、番茄葉霉病菌、小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌、黃瓜炭疽病菌、小麥紋枯病菌、蘋果炭疽病菌、棉花立枯病菌、玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌：西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供；培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

氯化鈉、石油醚、無水硫酸鈉：分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；丙酮：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-MS/QP2010，日本島津公司；智能型生化培養(yǎng)箱：SPX-150B，上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋：D-1，上海喬躍電子科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R213，上海申生科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 野菊花精油提取

將在咸陽郊區(qū)采摘的新鮮野菊花進(jìn)行篩選放入50 ℃烘箱烘干，t≈3 h，然后粉碎過450 μm篩。準(zhǔn)確稱量45 g，置于1 000 mL圓底蒸餾燒瓶中，加500 mL蒸餾水浸泡4 h，按中華人民共和國藥典(2010年版)精油提取方法[15]連續(xù)蒸餾7.5 h。將所得餾出液用氯化鈉進(jìn)行飽和，靜置一段時(shí)間后，將飽和的提取液用石油醚萃取其精油，反復(fù)萃取3次，分出醚層，然后把萃取液合并再加無水硫酸鈉干燥6 h,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干燥后的萃取液,用丙酮作溶劑，收集獲得野菊花精油0.372 g。

1.2.2 GC-MS分析

氣相色譜條件為島津CBP5-M25-025彈性石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；柱流量1 mL/min,進(jìn)樣量1 μL，柱初溫50 ℃,保溫2 min,以5 ℃/min升溫速率升至240 ℃,保留溫度5 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃;柱前壓55.5 kPa,分流比1∶50。

質(zhì)譜條件為電子轟擊離子源(EI),離子源溫度200 ℃,電子能量70 eV,GC-MS接口溫度220 ℃，電子倍增器電壓0.97 V，溶劑峰切斷時(shí)間2.0 min,質(zhì)譜檢測(cè)起測(cè)時(shí)間2.5 min。掃描模式為全掃描模式m/z，質(zhì)量掃描范圍29～350,質(zhì)譜圖計(jì)算機(jī)檢索數(shù)據(jù)庫：NIST 147。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定

對(duì)選用的小麥紋枯病菌、辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌等11種病原菌，采用生長速率法[16]測(cè)試野菊花精油的抑菌活性。配制野菊花精油丙酮溶液，首先配制ρ(野菊花精油丙酮)=1 500 mg/L溶液的母液，然后將該溶液稀釋配成ρ(野菊花精油丙酮)=1 000、750、500、250 mg/L的系列溶液后分別加入到配置好的PDA培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)皿，制成系列培養(yǎng)基平面,在該平面上對(duì)供試的11種病原菌分別進(jìn)行接種,接種完成后輕置于已經(jīng)設(shè)定好溫度的生化培養(yǎng)箱，在26 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取出后，分別用卡尺采用十字交叉法測(cè)量各供試病原菌其菌落生長直徑3次,取其平均值。根據(jù)公式(1)和公式(2)計(jì)算菌絲生長抑制率。

菌落生長直徑=2次直徑平均值-4.0(菌餅直徑)

(1)

菌絲生長抑制率=(對(duì)照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對(duì)照菌落生長直徑×100%

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 精油收率

用水蒸氣蒸餾法對(duì)采自陜西咸陽郊區(qū)山坡的野菊花進(jìn)行精油提取，得到的野菊花精油為淡黃色有辛香味的油狀液體，計(jì)算出精油的產(chǎn)率為0.827%。

2.2 精油化學(xué)成分的GC-MS分析

按前述的實(shí)驗(yàn)方法及條件,對(duì)野菊花精油的化學(xué)成分用GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析,得到總離子流圖，見圖1。

t/min圖1 野菊花精油總離子流圖

對(duì)總離子流圖中各個(gè)化合物質(zhì)譜圖譜應(yīng)用SHIMADZU GCMSsolution Release 2.10專業(yè)分析軟件，NIST147數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,比較其質(zhì)荷比、基峰和相對(duì)豐度，結(jié)合解析相關(guān)圖譜，按峰面積歸一法計(jì)算確定各組成化合物的相對(duì)含量；通過與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、分析,確定出的野菊花精油的成分有43種,占總餾出峰面積的88.36%，見表1。

表1 野菊花精油化學(xué)成分

續(xù)表

由表1可知，其成分相對(duì)含量最高的是2-甲基二十烷，其次是左旋樟腦、桉油醇、十八烷、8-己基十五烷、反式-α-香檸檬烯。還含有少量其他的烴類、醇類、酯類、酸類、烯類等。

2.3 野菊花精油抑菌活性測(cè)試

野菊花精油用生長速率法對(duì)供試的11種病原菌進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，野菊花精油對(duì)供試的11種病原菌抑菌作用都有差異，在提供的劑量下大多與ρ(野菊花精油丙酮)呈正相關(guān)。其對(duì)小麥紋枯病菌的抑制率最強(qiáng)，其系列ρ(野菊花精油丙酮)對(duì)應(yīng)的抑制率達(dá)到95%，對(duì)番茄葉霉病菌、玉米大斑病菌的抑制率高于80%，僅次于小麥紋枯病菌；對(duì)黃瓜炭疽病菌、番茄早疫病菌稍低一些，而對(duì)辣椒疫霉病菌和小麥赤霉病菌的抑菌率在不同ρ(野菊花精油丙酮)時(shí)幾乎不變，對(duì)其他幾種病菌也有相對(duì)較低的抑制率。

表2 野菊花精油對(duì)11種病原菌的抑制率

3 結(jié) 論

利用水蒸氣蒸餾法提取野菊花精油。通過GC-MS聯(lián)用儀對(duì)其精油進(jìn)行化學(xué)成分分析，鑒定出43種成分，占總餾出峰面積的88.36%。檢測(cè)得到野菊花精油化學(xué)成分相對(duì)含量最高為2-甲基二十烷，其次為左旋樟腦、桉油醇、十八烷、8-己基十五烷、反式-α-香檸檬烯。還含有少量其他的烴類、醇類、酯類、酸類、烯類等。研究與何小珍[17]和Jing Chang-Liang[18]等對(duì)野菊花成分研究的結(jié)果有較大的差異，其主要原因是野菊花品種的多樣性以及不同的提取方法、產(chǎn)地、氣候、土壤等因素都有一定關(guān)系。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)用野菊花精油對(duì)供試的11種病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定表明，其精油對(duì)小麥紋枯病菌的抑制率最強(qiáng)，抑制率達(dá)到95%，對(duì)番茄葉霉病菌、玉米大斑病菌的抑制率高于80%，對(duì)其他的病原菌都有不同程度的抑制率。這和前期劉曉丹[19]等研究的野菊莖葉揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌抑制作用強(qiáng)度略有不同，其原因與野菊的部位、產(chǎn)地等不同有關(guān)。由此可見，野菊花精油含有重要的抑菌活性成分，希望在繼續(xù)的研究中分離這些活性成分,并進(jìn)一步做抑菌實(shí)驗(yàn)，有可能發(fā)現(xiàn)具有新型殺菌活性的先導(dǎo)化合物，為新型抑菌農(nóng)藥的創(chuàng)制奠定良好的基礎(chǔ)。