賀茂芳,秦 蓓,張 博,胡婭琪,唐一梅,周 慧
(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021;2.西安醫(yī)學(xué)院 藥物研究所,陜西 西安 710021)
沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)是一種人工合成的選擇性β-受體激動(dòng)劑,可以促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的沉積和脂肪的分解,明顯加快和提高飼料轉(zhuǎn)化率,提高酮體的瘦肉率,因此被用作畜禽的促生長(zhǎng)劑和飼料添加劑[1]。SAL易在人和動(dòng)物的內(nèi)臟、器官中殘留,嚴(yán)重危害人類的健康[2]。因此,高效、實(shí)用的檢測(cè)方法對(duì)于畜產(chǎn)品安全有著重要意義。目前,SAL的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7]、電泳法(CE)[8-9],免疫分析法[10-11]等。然而,這些方法儀器昂貴,操作復(fù)雜,不易推廣普及。
與儀器分析法相比,基于納米金顆粒(Au NPs)的可視化檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀,廣泛應(yīng)用于生物、環(huán)境和食品分析。Au NPs可視化檢測(cè)的原理為單分散的Au NPs在溶液中呈現(xiàn)酒紅色,當(dāng)加入被檢測(cè)物時(shí),Au NPs表面的功能基團(tuán)與被檢測(cè)物發(fā)生反應(yīng),引起交聯(lián)聚集,從而使顆粒間的等離子體耦合發(fā)生改變,吸收峰發(fā)生紅移,溶液的顏色由紅色變?yōu)樽仙蛩{(lán)色[12]?;贏u NPs的可視化檢測(cè)不依賴大型儀器,溶液顏色變化即可作為讀出信號(hào),信號(hào)檢出速度較快,成本低廉,適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和不具備大型儀器的場(chǎng)所[13]。
根據(jù)硼親和原理,硼酸基在堿性條件下可與1,2-二羥基和1,3-二羥基結(jié)合,形成五元或六元環(huán)酯,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)順式二羥基化合物的特異性識(shí)別[14]。SAL分子中含有1,3-二羥基和氨基,因此,作者首先以檸檬酸三鈉為穩(wěn)定劑和還原劑制備Au NPs,然后將苯硼酸修飾于Au NPs表面。由于苯硼酸與1,3-二羥基特異性結(jié)合,同時(shí),Au NPs表面的羧基與氨基通過(guò)靜電吸引力結(jié)合,從而拉近Au NPs顆粒之間的距離,引起交聯(lián)聚集,Au NPs溶液的顏色由酒紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)SAL的可視化檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)便快捷,成本低廉,為SAL的檢測(cè)提供了新方法。
四水合氯金酸:質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%,3-氨基苯硼酸:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,N-羥基琥珀酰亞胺(NHS):質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC):質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;SAL標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%,上海三愛(ài)思試劑有限公司;4-巰基苯硼酸:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,北京百靈威科技有限公司;檸檬酸三鈉:分析純,國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。
電子天平:CPA225D,pH計(jì):PB-10,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):Cary-60,安捷倫科技有限公司;透析袋:HT1134-5,Yobios生物科技有限公司;透射電鏡:H-7650,日立科技有限公司。
1.2.1 苯硼酸功能化納米金(Au@PBA)的制備
1.2.1.1 Au NPs的制備
參照文獻(xiàn)[15],向圓底燒瓶中加入10 mL超純水、92 μLc(氯金酸)=97 mmol/L的溶液,加熱煮沸后,在磁力攪拌下迅速加入1.0 mLc(檸檬酸三鈉)=38.8 mmol/L的溶液,繼續(xù)加熱攪拌10 min,可觀察到溶液顏色由淡黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑?,最終變?yōu)榫萍t色;停止加熱,待溶液冷卻后轉(zhuǎn)移至透析袋中用水透析6 h,將得到的Au NPs溶液于4 ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1.2 EDC/NHS偶聯(lián)法合成Au@PBA
將3.32 mg 3-氨基苯硼酸、2.3 mg NHS溶解于2 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=5.6)中,再加入3.83 mg EDC,45 ℃下反應(yīng)1 h后,加入10 mL上述Au NPs溶液,調(diào)節(jié)溶液至pH=7.4,室溫下攪拌反應(yīng)6 h,將反應(yīng)液用水透析,直至水中無(wú)3-氨基苯硼酸的紫外吸收峰。
1.2.1.3 靜電自組裝法合成Au@PBA
取10 mL Au NPs溶液于小燒杯中,加入0.5 mg 3-氨基苯硼酸,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h,將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中用水透析,直至水中無(wú)3-氨基苯硼酸的紫外吸收峰。
1.2.1.4 配位共價(jià)鍵法合成Au@PBA
取10 mL Au NPs溶液于小燒杯中,用c(NaOH)=0.5 mol/L的溶液調(diào)節(jié)至pH≈11.0,攪拌下緩慢加入100 μLc(4-巰基苯硼酸)=0.1 mmol/L的溶液,室溫下攪拌反應(yīng)12 h;將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中用水透析,直至水中無(wú)4-巰基苯硼酸的紫外吸收峰。
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
稱取0.001 0 g SAL于10 mL容量瓶中,加入c(NH3-NH4Cl)=20 mmol/L緩沖液(pH=8.5)溶解,得到儲(chǔ)備液。使用時(shí),用緩沖液稀釋至所需濃度即可。
1.2.3 檢測(cè)方法
將制備好的Au@PBA溶液用NH3-NH4Cl緩沖液(pH=8.5)稀釋10倍,取該溶液900 μL于2 mL離心管中,加入100 μL SAL標(biāo)準(zhǔn)溶液,反應(yīng)10 min后掃描溶液的吸收光譜,對(duì)比SAL加入前后溶液最大吸收波長(zhǎng)的變化。
1.2.4 Au@PBA用量的選擇
量取100、200、300 μLρ(SAL)=1.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入到900、800、700 μLAu@PBA溶液中,10 min后掃描溶液的吸收光譜,計(jì)算650與530 nm處吸光度的比值(A650/A530)。改變?chǔ)?SAL)=1.0、0.50 μg/mL,方法同上。對(duì)比3種ρ(SAL)下A650/A530值,確定Au@PBA的最佳用量。
1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線
取900 μL Au@PBA于2 mL的離心管中,分別加入100 μLρ(SAL)=0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(平行5份),反應(yīng)10 min后,掃描溶液的吸收光譜,計(jì)算A650/A530,以A650/A530為縱坐標(biāo),ρ(SAL)為橫坐標(biāo)作圖。
首先,以檸檬酸三鈉為還原劑和穩(wěn)定劑,合成了Au NPs;然后采用3種不同的方法向Au NPs表面修飾苯硼酸,得到Au@PBA。在EDC/NHS偶聯(lián)法中,Au NPs表面的羧基和3-氨基苯硼酸形成酰胺鍵;自組裝法的原理是Au NPs表面的羧基與3-氨基苯硼酸通過(guò)靜電吸引力結(jié)合;配位共價(jià)鍵法的原理是4-巰基苯硼酸與Au NPs形成金屬配位鍵。通過(guò)比較這3種方法所得Au@PBA的穩(wěn)定性,選擇最佳合成方案。
經(jīng)過(guò)多次的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),配位共價(jià)鍵法合成的Au@PBA溶液放置1 d后由酒紅色變?yōu)榛宜{(lán)色,說(shuō)明其性質(zhì)極不穩(wěn)定,發(fā)生了團(tuán)聚。
EDC/NHS偶聯(lián)法和靜電自組裝法合成Au@PBA的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖見(jiàn)圖1。
λ/nma EDC/NHS偶聯(lián)法
λ/nmb 靜電自組裝法圖1 EDC/NHS偶聯(lián)法和靜電自組裝法合成Au@PBA的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖
由圖1可知,EDC/NHS偶聯(lián)法合成的Au@PBA相比于Au NPs發(fā)生了明顯的紅移,其最大吸收波長(zhǎng)為610 nm,說(shuō)明Au@PBA性質(zhì)不穩(wěn)定,發(fā)生了輕微的團(tuán)聚;通過(guò)靜電自組裝法合成的Au@PBA的最大吸收波長(zhǎng)為535 nm,相比于Au NPs幾乎沒(méi)有變化,這說(shuō)明Au@PBA的性質(zhì)穩(wěn)定,基本沒(méi)有發(fā)生團(tuán)聚。
Au NPs和靜電自組裝法合成的Au@PBA透射電鏡圖見(jiàn)圖2。
由圖2可知,靜電自組裝前的Au NPs粒徑約為15 nm,且分散性好、粒徑均勻;經(jīng)過(guò)3-氨基苯硼酸修飾后,Au@PBA仍然分散良好、未發(fā)生團(tuán)聚,這與紫外吸收光譜的結(jié)果一致。因此,選擇靜電自組裝法合成的Au@PBA進(jìn)行SAL的檢測(cè)。
a Au NPs
b 靜電自組裝法合成的Au@PBA圖2 Au NPs和靜電自組裝法合成的Au@PBA透射電鏡圖
向900 μL Au@PBA溶液中加入100 μLρ(SAL)=1.5 μg/mL的溶液,反應(yīng)10 min后,溶液顏色由淺紅色變?yōu)樯钏{(lán)色。
向Au@PBA中加入SAL前、后的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖3。
λ/nm圖3 向Au@PBA中加入SAL前、后的紫外吸收光譜圖
由圖3可知,加入SAL后,Au@PBA溶液的最大吸收波長(zhǎng)由530 nm紅移至650 nm,這說(shuō)明SAL與Au@PBA結(jié)合,使Au@PBA發(fā)生了交聯(lián)聚集。
向Au@PBA中加入SAL前、后的透射電鏡圖見(jiàn)圖4。
a 加入SAL前
b 加入SAL后圖4 向Au@PBA中加入SAL前、后的透射電鏡圖
由圖4可知,加入SAL前Au@PBA的分散良好,而加入SAL后Au@PBA發(fā)生了明顯的團(tuán)聚,這一結(jié)果與紫外吸收光譜分析一致。
SAL與Au@PBA的結(jié)合原理見(jiàn)圖5。
圖5 Au@PBA與SAL結(jié)合的示意圖
由圖5可知,SAL分子中含有1,3-二羥基和氨基,可分別與Au@PBA表面的硼酸基和羧基結(jié)合,使Au@PBA發(fā)生交聯(lián)聚集,因而最大吸收波長(zhǎng)由530 nm紅移至650 nm,溶液由酒紅色變?yōu)樯钏{(lán)色。因此,根據(jù)兩波長(zhǎng)下吸光度的變化與ρ(SAL)的關(guān)系,可實(shí)現(xiàn)對(duì)SAL的定量檢測(cè)。
Au@PBA的用量是影響靈敏度的關(guān)鍵因素。在ρ(SAL)=0.5、1.0、1.5 μg/mL時(shí),考察了V(Au@PBA)∶V(SAL)對(duì)吸光度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。
由圖6可知,V(Au@PBA)∶V(SAL)=9∶1,A650/A530的值最大;并且隨著ρ(SAL)的增大,A650/A530也逐漸增大。因此,選擇V(Au@PBA)∶V(SAL)=9∶1時(shí)對(duì)SAL進(jìn)行檢測(cè),可獲得最高的靈敏度。
ρ(SAL)/(μg mL-1)圖6 V(Au@PBA)∶V(SAL)對(duì)A650/A530的影響
將100 μLρ(SAL)=0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg/mL的溶液與900 μL Au@PBA溶液混合(分別記為1、2、3、4、5、6樣品),反應(yīng)10 min后,可以觀察到溶液顏色變化,結(jié)果見(jiàn)圖7。
圖7 不同ρ(SAL)溶液與Au@PBA混合后溶液顏色的變化
由圖7可知,溶液顏色由酒紅變?yōu)樗{(lán)灰色,并且ρ(SAL)越大,藍(lán)色越明顯,這是高ρ(SAL)溶液與Au@PBA結(jié)合,促使Au@PBA發(fā)生交聯(lián)聚集的結(jié)果。
以A650/A530為縱坐標(biāo)、ρ(SAL)為橫坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖8。
ρ(SAL)/(μg·mL-1)圖8 標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖8可知,線性關(guān)系良好,因此可用于對(duì)SAL的定量檢測(cè)。
對(duì)Au@PBA的3種合成方法進(jìn)行了對(duì)比,其中,以檸檬酸三鈉為還原劑和穩(wěn)定劑合成的Au NPs與3-羧基苯硼酸通過(guò)靜電自組裝得到的Au@PBA性質(zhì)穩(wěn)定,并成功應(yīng)用于SAL的檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)便快捷、成本低廉、肉眼可見(jiàn),并且能在10 min內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果,具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景。