李學(xué)峰， 韓 璐， 劉懿萱， 徐亞男， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

狼爪瓦松(OrostachyscartilagineaA. Ber)為景天科瓦松屬的一種2年生或多年生的草本植物[1]，在我國主要分布于山東、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等省區(qū)，它既具有優(yōu)異的觀賞應(yīng)用價值，又是一種頗具開發(fā)價值的野生花卉[2]。狼爪瓦松含多糖類、黃酮類、酚類、有機(jī)酸類以及甾醇類等多種有效成分[3]，具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、降血脂、降血壓等藥理作用。植物多糖已被認(rèn)為具有多種藥理作用，如清除自由基，降血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫活性、抗突變、抗病毒、抗菌及抗腫瘤等作用，在保健品、藥品生產(chǎn)等領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛[4-7]。同時狼爪瓦松愈傷組織中富含多種有效成分，其中多糖是含量較高的一種。因此，通過對狼爪瓦松愈傷組織中多糖進(jìn)行提純來進(jìn)一步研究其功效及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn)。

大孔樹脂具有多孔結(jié)構(gòu)和材料性質(zhì)，其吸附分離技術(shù)同時兼具機(jī)械篩分和化學(xué)吸附的特點(diǎn)，干擾因素少，選擇性高，可以重復(fù)循環(huán)利用，多用于黃酮、多糖和多酚等生物活性物質(zhì)的提純[8]。楊波等[9]在AB-8和D101大孔吸附樹脂分離純化玉竹多糖研究中發(fā)現(xiàn)，D101和AB-8樹脂都有利于提高多糖的純化，劉紅梅等[10]在S-8大孔樹脂對灰樹花子實(shí)體多糖酶解液色素吸附的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，S-8型樹脂有利于灰樹花子實(shí)體的多糖純化，劉明等[11]在柴達(dá)木枸杞果渣中黃酮和多糖的制備工藝研究中發(fā)現(xiàn)，HP-20型樹脂對柴達(dá)木枸杞有很好的多糖純化作用。由此可見，D101、AB-8、S-8和HP-20這4種型號的樹脂均對植物多糖純化有效。由于狼爪瓦松被過度采摘導(dǎo)致其野生資源越來越少，加上人工栽培體系尚未完善，嚴(yán)重影響著狼爪瓦松的進(jìn)一步開發(fā)和利用。所以，通過生物反應(yīng)器可在中短期內(nèi)培養(yǎng)出大量狼爪瓦松愈傷組織，是獲取植物原材料的一種有效途徑[12-13]。因此，該研究利用大孔吸附樹脂法對愈傷組織中的多糖進(jìn)行純化，旨在為狼爪瓦松愈傷組織多糖的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照張萬博[14]的方法進(jìn)行狼爪瓦松愈傷組織的增殖培養(yǎng)。在25 d后收獲愈傷組織，用流水充分沖洗，在45 ℃恒溫箱中烘干后作為該研究的試驗(yàn)材料。將愈傷組織干品浸泡在70%的乙醇(料液比為 1∶15)中，60 ℃下冷凝回流1 h后，抽濾，收集濾渣。濾渣再次進(jìn)行冷凝回流，重復(fù)3次。合并濾渣，揮干乙醇后，用100 ℃熱水提取1 h，提取3次，將每次抽濾的濾液進(jìn)行合并，減壓濃縮，加入乙醇沉淀離心，即得愈傷組織多糖粗提物，用于之后試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

將所需的大孔樹脂浸泡在95%乙醇溶液中，浸泡24 h 后上柱，并使用95%乙醇溶液充分沖洗樹脂柱，再用蒸餾水繼續(xù)沖洗，直至流出溶液無乙醇味。將處理好的樹脂加入4%的鹽酸溶液浸泡樹脂4 h，之后用蒸餾水沖洗，至流出液體的pH值呈中性。最后使用4%的氫氧化鈉浸泡樹脂4 h，之后用蒸餾水沖洗，至流出液體的pH值呈中性。

1.2.2 大孔吸附樹脂種類的篩選

利用靜態(tài)吸附法[15]篩選樹脂種類。試驗(yàn)用4種大孔吸附樹脂(D101、AB-8、S-8和HP-20)購于廊坊麥克森化工建材有限公司(河北，中國)。將狼爪瓦松愈傷組織粗提物用蒸餾水稀釋到0.8 mg/mL后，測定其多糖濃度(C0)。將3 g預(yù)處理后的大孔吸附樹脂樹后放入200 mL三角瓶中，加入20 mL(V1)的稀釋粗提物(0.8 mg/mL)，使樹脂吸附多糖，4 h后抽濾，并測定濾液中多糖含量(C1)。抽濾后的樹脂再次置入三角瓶中，加入20 mL(V2)的95%乙醇洗脫多糖。4 h后抽濾，收集濾液，測定多糖含量(C2)。根據(jù)測定的多糖吸附率及解吸率，選擇出供試驗(yàn)的最佳樹脂種類。

吸附率/%= (C0C1)/C0100

解吸率/%=(C2V2) / (C0C1)V1100

1.2.3 進(jìn)樣濃度、進(jìn)料體積、進(jìn)料流速的篩選

根據(jù)大孔樹脂種類試驗(yàn)結(jié)果，選用AB-8樹脂進(jìn)行預(yù)處理，并注入樹脂柱(柱徑∶柱高=1∶10)，試驗(yàn)方法如下。

1) 進(jìn)樣濃度篩選試驗(yàn)：將粗提物濃度設(shè)置為1.2、1.3、1.4、1.5 mg/mL后，分別進(jìn)樣，進(jìn)料流速為1 BV/h(BV為樹脂柱體積)，進(jìn)料總體積為2 BV。

2) 進(jìn)料體積篩選試驗(yàn)：進(jìn)樣濃度設(shè)置為(1)中最佳濃度，將進(jìn)料流速調(diào)節(jié)至1 BV/h，進(jìn)料總體積為3.5 BV，每進(jìn)料0.25 BV收集1次流出液體。

3) 進(jìn)料流速篩選試驗(yàn)：進(jìn)料流速分別設(shè)置為1、2、3 BV/h，進(jìn)樣濃度為試驗(yàn)1)中最佳濃度，進(jìn)料體積為試驗(yàn)2)中最佳體積。

所有處理中均收集流出液，減壓濃縮并干燥，稱取干燥后的多糖0.01 g，用蒸餾水定容至100 mL，測定多糖濃度，判斷多糖吸附情況，篩選出最佳處理。

1.2.4 洗脫劑濃度、洗脫劑體積和洗脫流速的篩選

洗脫劑濃度篩選采用靜態(tài)吸附試驗(yàn)法，以乙醇作為洗脫劑。取3 g預(yù)處理的AB-8樹脂放入三角瓶中，加入0.8 mg/mL的粗提物20 mL，4 h后抽濾。將抽濾后的樹脂再次置于三角瓶中，并加入20 mL不同濃度的乙醇(55%、65%和75%)浸泡4 h后抽濾。收集濾液減壓濃縮，用蒸餾水定容至10 mL后測定多糖濃度，判斷多糖解吸情況，篩選洗脫劑濃度。

為了篩選洗脫劑體積和洗脫流速，預(yù)處理的AB-8樹脂上柱后，加入粗提取，進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣體積、進(jìn)樣流速均調(diào)節(jié)為試驗(yàn)1.2.3中篩選出的最佳條件。進(jìn)樣過程結(jié)束后，用蒸餾水沖洗樹脂柱，直至流出液體無色后，加入55%乙醇進(jìn)行多糖解吸。

1) 洗脫劑體積篩選試驗(yàn)：洗脫流速調(diào)節(jié)為1 BV/h，每0.25 BV洗脫劑后進(jìn)行1次流出液體收集，直至加入3 BV的洗脫劑。

2) 洗脫流速篩選試驗(yàn)：洗脫劑體積調(diào)節(jié)為試驗(yàn)1)中最佳洗脫劑體積，洗脫流速分別設(shè)置為1、2、3 BV/h。

所有處理中，收集流出液體，并進(jìn)行減壓濃縮并干燥，稱取干燥后的多糖0.01 g用蒸餾水定容至100 mL，測定多糖濃度，判斷多糖解吸情況，篩選出最佳處理。

1.2.5 多糖濃度的測定

參照張青等[16]的方法測定多糖的含量。為了繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取100 mg干燥的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解定容至100 mL，分別取0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25和1.5 mL用蒸餾水定容至10 mL后，配制成不同濃度。各濃度的葡萄糖溶液1 mL中分別加入1 mL的5 %苯酚溶液和5 mL的濃硫酸，空白對照為蒸餾水，反應(yīng)30 min后測定490 nm處的吸光值，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

為測定樣品溶液中的多糖含量，取樣品溶液1 mL依次加入1 mL 5 %苯酚溶液和5 mL的濃硫酸，反應(yīng)30 min后測定490 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)處理均設(shè)置3次重復(fù)。利用Graphpad Prism 7軟件程序，采用鄧肯式新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼爪瓦松愈傷組織粗提物

用5 L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織，在25 d時可以收獲鮮重為700 g的狼爪瓦松愈傷組織，并進(jìn)行烘干。將愈傷組織干品用蒸餾水提取后可以獲得5.5 g粗提物，提取率為17%，對粗提物的活性物質(zhì)含量進(jìn)行測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多糖含量為381.0 mg/g。將得到的粗提物用于進(jìn)一步的多糖純化。

2.2 大孔樹脂種類的篩選

不同種類的大孔吸附樹脂對狼爪瓦松愈傷組織多糖吸附和解脫的效果不同。從狼爪瓦松愈傷組織多糖吸附的結(jié)果看出，AB-8和S-8樹脂對多糖的吸附率明顯高于D101和HP-20樹脂，吸附率達(dá)96%以上，說明AB-8和S-8 2種樹脂能夠較好地吸附狼爪瓦松愈傷組織多糖。從解吸狼爪瓦松愈傷組織多糖的情況來看，用乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D101和AB-8樹脂的解吸率顯著高于S-8和HP-20樹脂(圖1)。綜上所述，AB-8樹脂的吸附率和解吸率明顯高于其它種類的樹脂，所以，該研究選用AB-8大孔樹脂進(jìn)行進(jìn)一步的狼爪瓦松愈傷組織多糖純化條件的研究。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3 進(jìn)樣濃度、進(jìn)料體積和進(jìn)料流速對狼爪瓦松愈傷組織多糖吸附的影響

采用動態(tài)吸附法對進(jìn)樣濃度、進(jìn)料體積及進(jìn)料流速對大孔樹脂吸附多糖的影響進(jìn)行了研究。當(dāng)進(jìn)樣濃度為1.3 mg/L時，吸附率顯著高于進(jìn)樣濃度1.2、1.4和1.5 mg/L(圖2)，說明此濃度樹脂可以很好地吸附多糖，因此，選用進(jìn)樣濃度為1.3 mg/mL。在進(jìn)料體積為0.5～2 BV時，隨進(jìn)料體積的增加流出液中多糖濃度緩慢增加；但進(jìn)料體積超過2 BV時，吸附率急劇降低(圖3)，說明進(jìn)料體積為2 BV時，樹脂吸附多糖的量已接近飽和，繼續(xù)添加樣品，多糖會泄露，會造成樣品浪費(fèi)。進(jìn)料流速對樹脂吸附多糖的影響也很大，流速越高多糖泄露越多，當(dāng)進(jìn)料流速為1 BV/h時，流出液中多糖含量顯著低于進(jìn)料流速為2和3 BV/h(圖4)。說明1 BV/h進(jìn)料流速下，樹脂可很好地吸附多糖。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上有顯著差異。

圖3 進(jìn)料體積對多糖吸附的影響

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.4 洗脫劑的濃度、體積和流速對狼爪瓦松愈傷組織多糖解吸的影響

以乙醇作為洗脫劑，當(dāng)洗脫劑濃度為65%時，樹脂對多糖的解吸率顯著高于55%和75%，說明用65%洗脫劑對樹脂進(jìn)行洗脫時，樹脂吸附的多糖可最大程度地解吸下來(圖5)。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上差異顯著。

進(jìn)一步采用動態(tài)附法對洗脫劑體積和洗脫流速對多糖解吸的影響進(jìn)行了測定。當(dāng)洗脫劑體積0.25～1.25 BV時，隨著洗脫劑體積的增加，流出液中多糖濃度增加，洗脫劑體積繼續(xù)增加后，多糖濃度下降，當(dāng)洗脫劑體積達(dá)到2.5 BV時，多糖濃度不再減少，說明2.5 BV的洗脫劑可以最大量地將多糖解吸出來，是較為適宜的洗脫劑體積(圖6)。因此，對不同洗脫流速的影響進(jìn)行調(diào)查時，使用洗脫劑體積為2.5 BV。當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時，流出液的多糖高于1和3 BV/h組，說明當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時，對多糖解吸效果較好，因此，選擇2 BV/h為最佳的洗脫流速(圖7)。

圖6 洗脫劑體積對多糖解吸的影響

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上差異顯著。

3 結(jié)論與討論

高效、安全地提取植物中天然生物活性物質(zhì)是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。目前，已經(jīng)開發(fā)出多種提純方法來提純天然活性物質(zhì)，如超臨界流體萃取法[17]、高速逆流色譜法、雙水相萃取法、高效液相色譜法等，然而這些方法在應(yīng)用中存在對環(huán)境造成污染、操作過程復(fù)雜、人工成本高、不適合工業(yè)化大量生產(chǎn)等缺點(diǎn)。因此，尋找一種操作簡單、高效率、低成本的純化方法極為重要。大孔吸附樹脂是一種高分子合成材料，具有良好的吸附性質(zhì)和解脫性，同時可以重復(fù)利用，可以高效、簡單、環(huán)保、節(jié)能地純化植物中的天然活性物質(zhì)[18]。目前已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在天然活性物質(zhì)的純化和分離，如黃酮、多酚和多糖類化合物的純化。研究發(fā)現(xiàn)，AB- 8型樹脂對植物多糖具有良好的吸附和解析作用，可以用來純化植物多糖。張濤濤[19]在大孔樹脂純化杜仲多糖工藝研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上樣濃度為0.6 mg/mL，以1.0 mL/min流速上樣至AB-8型大孔樹脂吸附后，用150 mL的65%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫時，樹脂對多糖的吸附率和解吸率分別為90.6%和90.2%，最終多糖含量可達(dá)到35.8%。孫偉等[20]用大孔樹脂純化桑白皮多糖的工藝研究中發(fā)現(xiàn)，D-101 型大孔吸附樹脂分離純化桑白皮多糖的最佳上樣條件為：pH值3.0，上樣速度為2.0 BV/h，上樣濃度為4.0 mg/h。而最佳洗脫條件為75%的乙醇洗脫劑用量為3.5 BV、流速為1.0 BV/h，經(jīng)過該工藝純化后，秦白皮多糖的純度達(dá)到74.55%。邱曉[21]在黨參多糖的提取純化工藝及應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，黨參多糖分離純化工藝的上樣濃度10 mg/mL、上樣體積160 mL、柱徑高比1∶8、洗脫液為5%乙醇溶液，所得固體產(chǎn)物中黨參多糖的含量為25.12%。同樣，該試驗(yàn)也得出AB-8為純化狼爪瓦松愈傷組織中多糖的最優(yōu)樹脂，但進(jìn)料濃度、流速、體積以及洗脫劑濃度、流速、體積與其它研究有差異，這可能與不同植物所含多糖種類不同相關(guān)。該研究中，大孔吸附樹脂對狼爪瓦松愈傷組織多糖純化的最佳條件是進(jìn)樣濃度為1.5 mg/mL，進(jìn)樣體積為2 BV，進(jìn)樣流速為1 BV/h，洗脫劑濃度為65%，洗脫劑體積為2.5 BV，洗脫流速為2 BV/h?？梢缘贸鲇么罂孜綐渲瑢亲ν咚捎鷤M織多糖進(jìn)行純化具有可行性。該結(jié)果為今后狼爪瓦松愈傷組織多糖純化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為狼爪瓦松資源的有效開發(fā)利用提供新途徑，且大孔樹脂的成本低廉、操作簡單、效率高，可為今后大規(guī)模生產(chǎn)提供科學(xué)參考。