周永生 熊延路 馮楊波 喬天運(yùn) 趙晉波 雷杰 姜濤 韓勇②

肺癌死亡率居惡性腫瘤之首［1-4］，其中大部分是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［5］，主要分為肺腺癌和肺鱗癌。多數(shù)患者首次確診已經(jīng)處于晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會且5年生存率較低［6］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多關(guān)于肺腺癌的突變基因，相關(guān)靶向藥物也取得了較好的臨床療效，如克唑替尼、奧希替尼等［7-11］。但肺癌患者總體的治愈率和生存率仍然較低［5-6，12］。同時(shí)，相對于肺腺癌，發(fā)現(xiàn)的肺鱗癌驅(qū)動(dòng)基因較少，有待繼續(xù)尋找和研究新的突變基因，為潛在的治療靶點(diǎn)提供線索。

P2Y6受體是P2RY6基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，屬于P2受體家族中的G蛋白偶聯(lián)受體，可以被細(xì)胞外核苷酸激活。P2Y6受體廣泛表達(dá)于多種組織，并參與包括氣道炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多種反應(yīng)［13］。在腫瘤研究方面，因腫瘤微環(huán)境中存在大量細(xì)胞外ATP、腺苷、UDP 和其他核苷酸［14-15］，P2Y受體家族在乳腺癌中的研究得到廣泛關(guān)注［16］。在原發(fā)性肝癌中，P2X4和P2X7受體可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性［17］。近年來，P2Y6受體在結(jié)直腸癌和胃癌中被發(fā)現(xiàn)具有相反的作用［18］。在結(jié)直腸癌中，P2Y6受體通過抑制細(xì)胞凋亡來誘導(dǎo)癌變，而P2Y6受體通過降低β-catenin轉(zhuǎn)錄活性抑制胃癌的生長［18-20］。肺癌相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)了P2受體家族的功能，如P2Y受體可能介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中ATP對腫瘤生長的激活作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，并調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)［21-23］。P2Y6受體參與了NSCLC 間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）抑制劑耐藥性的形成［24］。但P2RY6基因與NSCLC的臨床相關(guān)性以及與患者生存之間的關(guān)系尚缺乏充分的研究。本研究通過癌癥基因組圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）數(shù)據(jù)庫和基因表達(dá)集（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫以及通過病理標(biāo)本的免疫組織化學(xué)法檢測，探索NSCLC中P2RY6的表達(dá)量的臨床相關(guān)性以及與患者生存之間的關(guān)系，為探索NSCLC的發(fā)病機(jī)制、尋找新的防治方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料

從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中檢索得到GSE18842、GSE10072、GSE19804、GSE32863、GSE33532、GSE40275、GSE74706、GSE102287、GSE 21933、GSE33479、GSE8569、GSE62113數(shù)據(jù)集，見表1。用于比較NSCLC 患者的癌組織與癌旁組織基因表達(dá)差異。

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（http：//cancergenome.nih.gov）中獲得包含288 例肺鱗癌樣本、253 例肺腺癌樣本的完整臨床信息和生存期數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集，以及匹配的58例肺腺癌和51例肺鱗癌癌旁組織的基因表達(dá)譜。

表1 GEO數(shù)據(jù)庫NSCLC、肺腺癌和肺鱗癌數(shù)據(jù)集

肺鱗癌和肺腺癌組織來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，P2RY6 抗體購自美國Affinity Biosciences 公司（DF6956）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Servicebio 公司（G23303）。本研究涉及的病理標(biāo)本的使用均符合本機(jī)構(gòu)倫理委員會的倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 將石蠟包埋的肺鱗癌和肺腺癌組織切片在二甲苯和梯度乙醇中脫蠟，并在磷酸鹽緩沖液中沖洗；預(yù)處理后，以3%過氧化氫處理25 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶；使用牛血清白蛋白封閉；P2RY6 一抗孵育；磷酸鹽緩沖液洗滌后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育；二氨基聯(lián)苯胺和底物顯色劑顯色。

1.2.2 分組方法 根據(jù)P2RY6表達(dá)的中位數(shù)將患者分為P2RY6高表達(dá)組和低表達(dá)組。根據(jù)患者年齡的中位數(shù)，分為高年齡組和低年齡組；在肺鱗癌患者中，＞68歲為高年齡組，≤68歲為低年齡組；在肺腺癌患者中，＞66歲為高年齡組，≤66歲為低年齡組。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8版TNM肺癌分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖。采用KS檢驗(yàn)對P2RY6表達(dá)量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。采用符號秩檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)分析癌組織與癌旁組織基因表達(dá)差異。采用χ2檢驗(yàn)分析P2RY6的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對總生存期和無進(jìn)展生存期分別進(jìn)行單因素和多因素生存分析，并對分析結(jié)果進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫肺腺癌及肺鱗癌數(shù)據(jù)集中P2RY6的表達(dá)

采用正態(tài)分布Q-Q圖及直方圖對TCGA數(shù)據(jù)庫肺腺癌及肺鱗癌數(shù)據(jù)集中P2RY6表達(dá)量的分布特征進(jìn)行觀察（圖1），同時(shí)采用KS檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌和肺腺癌患者的癌組織中P2RY6表達(dá)量呈偏態(tài)分布，不服從正態(tài)分布（P＜0.000 1）?；跀?shù)據(jù)特征，采用符號秩檢驗(yàn)分析TCGA數(shù)據(jù)庫肺腺癌及肺鱗癌數(shù)據(jù)集中58例肺腺癌患者和51例肺鱗癌患者的癌組織與癌旁組織基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在肺腺癌和肺鱗癌患者中，癌組織中P2RY6表達(dá)顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。

2.2 GEO數(shù)據(jù)庫中P2RY6在NSCLC中的表達(dá)

為進(jìn)一步明確P2RY6 在NSCLC 中的表達(dá)情況，在GEO數(shù)據(jù)庫的多個(gè)數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了驗(yàn)證?；蛐酒臄?shù)據(jù)常呈偏態(tài)分布，且在樣本量較大的TCGA數(shù)據(jù)庫肺腺癌和肺鱗癌數(shù)據(jù)集中，P2RY6 表達(dá)量呈偏態(tài)分布，而GEO 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集樣本量相對較小。為避免統(tǒng)計(jì)學(xué)方法帶來的誤差，采用符號秩檢驗(yàn)等非參數(shù)檢驗(yàn)在GEO 數(shù)據(jù)庫中的GSE40275、GSE 74706、GSE102287、GSE62113、GSE33532、GSE18842數(shù)據(jù)集中，對P2RY6 在NSCLC 患者中的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)P2RY6 在癌組織中表達(dá)高于較癌旁組織（P＜0.001）。在GSE74706、GSE19804、GSE10072、GSE32863、GSE33479、GSE21933、GSE8569 數(shù) 據(jù) 集中，采用符號秩檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)對P2RY6 基因在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在兩者中P2RY6 表達(dá)均高于癌旁組織。在GSE21933、GSE8569 數(shù)據(jù)集中，采用秩和檢驗(yàn)對P2RY6 表達(dá)量在肺腺癌和肺鱗癌之間的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

2.3 病理標(biāo)本肺鱗癌和肺腺癌中P2RY6的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，通過免疫組織化學(xué)方法對空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室儲存的肺鱗癌以及肺腺癌病理組織中P2RY6 的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示肺鱗癌和肺腺癌的癌組織中P2RY6表達(dá)量均高于癌旁組織（圖3）。

圖1 ATCGA中P2RY6在肺鱗癌及肺腺癌中的表達(dá)

圖2 GEO中P2RY6的表達(dá)譜

圖3 病理標(biāo)本中肺鱗癌和肺腺癌的癌組織與癌旁組織的免疫組織化學(xué)圖

2.4 肺腺癌和肺鱗癌中P2RY6表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

在TCGA數(shù)據(jù)庫肺腺癌以及肺鱗癌數(shù)據(jù)集中，采用χ2檢驗(yàn)分析P2RY6的表達(dá)與肺鱗癌和肺腺癌患者的年齡、性別、TNM 分期、病理分期等臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示肺腺癌患者P2RY6表達(dá)與性別顯著相關(guān)（P=0.020），相較于肺腺癌男性患者，女性患者P2RY6 高表達(dá)，但肺腺癌患者P2RY6 表達(dá)與患者年齡、TNM 分期和病理分期無顯著相關(guān)性。P2RY6 表達(dá)與肺鱗癌患者年齡、性別、TNM分期和病理分期均無顯著相關(guān)性（P＞0.05，表2，3）。

表2 P2RY6表達(dá)與肺鱗癌臨床病理特征相關(guān)性 例

2.5 P2RY6表達(dá)與肺腺癌和肺鱗癌患者生存的關(guān)系

進(jìn)一步分析P2RY6表達(dá)與肺鱗癌和肺腺癌患者生存的相關(guān)性。在TCGA 數(shù)據(jù)庫肺腺癌以及肺鱗癌數(shù)據(jù)集中通過繪制Kaplan-Meier 生存曲線和采用Log-rank 進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明P2RY6 的表達(dá)與肺鱗癌患者的總生存期（P=0.010 1）和無進(jìn)展生存期（P=0.014 8）顯著相關(guān)，Kaplan-Meier 生存曲線趨勢也提示P2RY6高表達(dá)的肺鱗癌患者生存期低于P2RY6低表達(dá)患者，而肺腺癌中P2RY6 表達(dá)對患者生存期無顯著影響（圖4）。

圖4 TCGA肺腺癌與肺鱗癌數(shù)據(jù)中P2RY6表達(dá)和生存之間的關(guān)系

2.6 肺鱗癌患者生存影響因素

采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素分析。結(jié)果表明，P2RY6表達(dá)影響肺鱗癌患者的總生存期和無進(jìn)展生存期。P2RY6高表達(dá)是影響肺鱗癌患者總生存期和無進(jìn)展生存期的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，P2RY6表達(dá)是影響肺鱗癌患者總生存期和無進(jìn)展生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P2RY6高表達(dá)的肺鱗癌患者的總生存期（P=0.004；HR=1.765，95%CI：1.199～2.598）和無進(jìn)展生存期（P=0.007；HR=1.765，95%CI：1.199～2.598）較低表達(dá)患者更短（表4，5）。

表3 P2RY6表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征相關(guān)性 例

表4 TCGA數(shù)據(jù)庫肺鱗癌數(shù)據(jù)集中肺鱗癌患者總生存期影響因素的比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

表5 TCGA數(shù)據(jù)庫肺鱗癌數(shù)據(jù)集中肺鱗癌患者無進(jìn)展生存期影響因素的比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

3 討論

不同類型肺癌的驅(qū)動(dòng)基因不同，肺腺癌多為EGFR、ALK 等，肺鱗癌常見的驅(qū)動(dòng)基因?yàn)镕GFR1等［25］。驅(qū)動(dòng)基因的差異并不能完全作為肺癌的分類指標(biāo)，不同類型肺癌很可能存在不同的驅(qū)動(dòng)基因。不同類型肺癌之間的異質(zhì)性以及同一類型肺癌中驅(qū)動(dòng)基因的異質(zhì)性，導(dǎo)致了并非所有的肺癌患者均能從靶向藥物中獲益，肺癌總治愈率仍然較低，因此研究不同類型肺癌的不同驅(qū)動(dòng)基因可能會為未來的治療提供線索。

P2Y6受體廣泛表達(dá)于心臟、肺、脾臟、小腸、主動(dòng)脈、胎盤以及部分大腦區(qū)域［26］。P2Y6受體激活參與了血管炎性反應(yīng)，并通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的促炎性反應(yīng)，在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展中發(fā)揮不同作用［27-28］。小膠質(zhì)細(xì)胞中P2Y6的激活增強(qiáng)了其對損傷神經(jīng)元的吞噬作用，參與神經(jīng)損傷修復(fù)的炎癥反應(yīng)過程［29］。在疼痛研究中，P2Y6 在脊髓節(jié)段通過星形膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)性疼痛的維持，但該作用尚存在爭議［30-31］。在胃腸道腫瘤中，P2Y6 表現(xiàn)出相反的作用，P2Y6 受體在結(jié)直腸癌中通過抑制細(xì)胞凋亡來誘導(dǎo)癌變，而P2Y6受體通過降低β-catenin轉(zhuǎn)錄活性抑制胃癌的生長［18］。近期有研究表明，在肺癌中，P2Y6受體在促進(jìn)癌細(xì)胞存活和ALK抑制劑的耐藥性中發(fā)揮重要的作用［23-24］。但目前聚焦于P2RY6 表達(dá)與NSCLC 患者臨床特征和生存之間相關(guān)性的研究較少。靶向腫瘤致病基因的治療在臨床上取得了較好的療效，然而相關(guān)研究主要集中在肺腺癌，如克唑替尼等。鱗癌中靶向藥物相對較少，且肺癌患者的預(yù)后仍無顯著改善。癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，然而腫瘤的異質(zhì)性限制了相關(guān)基因的研究。近年來，基因芯片和二代測序等技術(shù)，使研究者可以高效地研究腫瘤基因表達(dá)譜，同時(shí)GEO、TCGA 數(shù)據(jù)庫收錄了大量的基因和臨床信息，促進(jìn)了腫瘤相關(guān)基因的研究，為發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤相關(guān)基因以及潛在藥物靶點(diǎn)提供了可能。

本研究發(fā)現(xiàn)，TCGA 數(shù)據(jù)庫中，肺腺癌和肺鱗癌患者癌組織中P2RY6表達(dá)均高于癌旁組織。為排除個(gè)體差異導(dǎo)致的抽樣誤差，在GEO 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了廣泛的驗(yàn)證，在GEO數(shù)據(jù)庫的多個(gè)數(shù)據(jù)集中，NSCLC患者癌組織中P2RY6表達(dá)均高于癌旁組織。進(jìn)一步亞組分析，發(fā)現(xiàn)肺腺癌和肺鱗癌中癌組織P2RY6 的表達(dá)量高于癌旁組織，但P2RY6 表達(dá)在肺鱗癌與肺腺癌之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。通過肺腺癌和肺鱗癌的病理標(biāo)本對數(shù)據(jù)庫中得到的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在肺腺癌以及肺鱗癌的癌組織中，P2RY6 的表達(dá)量明顯高于癌旁組織。上述研究均提示，P2RY6 可能在NSCLC 中扮演癌基因的角色，同時(shí)提示其可能與肺腺癌和肺鱗癌的臨床特征以及生存預(yù)后相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在TCGA數(shù)據(jù)庫中P2RY6表達(dá)量與肺腺癌和肺鱗癌臨床特征以及患者生存存在相關(guān)性。單因素生存分析提示，在肺鱗癌中，相較于P2RY6 低表達(dá)患者，高表達(dá)患者總體生存期和無進(jìn)展生存期更短。多因素生存分析提示，P2RY6 高表達(dá)是肺鱗癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步提示P2RY6 在肺鱗癌中可能是致病基因。在肺腺癌中，單因素生存分析未提示P2RY6 與患者的生存相關(guān)。但χ2檢驗(yàn)提示，肺腺癌中，女性患者P2RY6表達(dá)高于男性患者，提示該基因在腺癌患者中可能存在性別差異。上述研究結(jié)果均提示，P2RY6 可能在肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，并影響患者的預(yù)后，為探索肺鱗癌病理機(jī)制提供一定參考。

傳統(tǒng)研究中，根據(jù)癌癥相關(guān)基因是否促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生，通常將其分為癌基因和抑癌基因，但這種二分類法并不能準(zhǔn)確全面地概括某一癌癥相關(guān)基因的全貌。在基因?qū)用?，?jīng)典的p53基因在早期曾被認(rèn)為是癌基因［32］，但后來發(fā)現(xiàn)其野生型發(fā)揮抑癌基因的作用。在蛋白質(zhì)層面，同一基因編碼的蛋白產(chǎn)物在不同狀態(tài)下發(fā)揮不同作用。如轉(zhuǎn)錄因子KLF5，根據(jù)其乙酰化狀態(tài)可以分別發(fā)揮促腫瘤或抗腫瘤的作用［33］。因此，同一基因功能的差異可能發(fā)生在DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)等各個(gè)層面［34］。正如在胃腸道腫瘤中，P2RY6 在胃癌與結(jié)直腸癌中具有不同的作用一樣［18］，P2RY6 在同一系統(tǒng)的不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用，可能是由于其在肺鱗癌與肺腺癌中發(fā)揮作用的通路不同，但目前尚缺乏相關(guān)的研究。

本研究推測，P2RY6 很可能在肺鱗癌中通過抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致患者生存率降低。而在肺腺癌中，可能由于其他更為重要的信號通路存在，進(jìn)而掩蓋了P2RY6 在肺腺癌中的作用。除此之外，也可能由于P2RY6 在肺鱗癌中發(fā)揮作用的通路與肺腺癌不同，從而在肺腺癌中不發(fā)揮癌基因的作用。因此，盡管本研究發(fā)現(xiàn)P2RY6 在肺鱗癌和肺腺癌中均高表達(dá)，但是其僅在肺鱗癌中是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但仍需進(jìn)一步研究闡明其作用存在差異的原因。

本研究具有一定的局限性，首先需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以應(yīng)對腫瘤廣泛的異質(zhì)性，另外缺乏系統(tǒng)的體外細(xì)胞、體內(nèi)動(dòng)物研究和相應(yīng)分子機(jī)制研究，本課題組將在今后的工作中進(jìn)一步完善。

綜上所述，P2RY6在NSCLC中普遍高表達(dá)，且在肺腺癌和肺鱗癌中均高表達(dá)，同時(shí)與肺鱗癌患者的生存密切相關(guān)，P2RY6 高表達(dá)的肺鱗癌患者具有更差的臨床預(yù)后和更短的生存期。