賴運(yùn)平 劉新春 王丹丹 袁金娥 馮宗云

摘要：為了探討藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）種子黃酮的乙醇提取最佳條件，進(jìn)而為藜麥黃酮的開發(fā)和高黃酮品種的篩選提供理論依據(jù)，采用4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對藜麥種子黃酮含量的影響。結(jié)果表明，各因素對藜麥種子黃酮提取含量的影響程度為乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>料液比>提取時(shí)間。藜麥種子黃酮最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶50（g∶mL）、提取時(shí)間50 min和提取溫度50 ℃。

關(guān)鍵詞：藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）;種子;黃酮;提取條件

中圖分類號：S512.9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）18-0103-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.020

Optimizing of extraction process of flavonoids from Chenopodium quinoa Willd. seeds

LAI Yun-ping1， LIU Xin-chun2， WANG Dan-dan1， YUAN Jin-e1， FENG Zong-yun2

（1.Chengdu Agricultural College， Chengdu? 611130， China; 2.College of Agronomy， Sichuan Agricultural University， Chengdu? 611130， China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of flavonoids from Chenopodium quinoa Willd. seeds， as well as to provide theoretical basis for flavonoids exploitation and high flavonoids variety screening. Orthogonal design L9（34） test including four factors such as ethanol? volume fraction， solid-liquidratio， extracting time and extracting temperature was investigated. The results showed that the influence degree of each factor on extraction content of flavonoid from Chenopodium quinoa Willd. seeds were ethanol volume fraction> extraction temperature> solid-liquidratio> extraction time. The optimum extracting conditions were extracting reagent 90% of ethanol， 1∶50（g∶mL） of solid-liquidratio， 50 min of extraction time and 50 ℃ of extraction temperature.

Key words： Chenopodium quinoa Willd.; seed; flavonoids; extraction process

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）又稱南美藜、藜谷、印第安麥，為藜科藜屬一年生雙子葉草本植物，原產(chǎn)于安第斯山脈地區(qū)，有5 000多年種植歷史，是安第斯山脈重要的糧食作物之一，被印加人稱為“谷物之母”和“安第斯山的真金”[1]。藜麥具有非常高的營養(yǎng)價(jià)值，其種子富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、黃酮、B族維生素、維生素E、鈣、鐵、鋅、銅、錳、鎂、鉀和硒等微量營養(yǎng)元素，而且含有人體所需的全部必需氨基酸，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)為是惟一的單一植物即可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物[2]，美國國家航空航天局更是將藜麥視為人類未來移民外太空的理想“太空糧食”[3]。為了讓世界關(guān)注藜麥的生物多樣性和營養(yǎng)價(jià)值，讓藜麥在糧食和營養(yǎng)安全方面發(fā)揮重要作用，聯(lián)合國大會(huì)已將2013年設(shè)為國際藜麥年[4]。

黃酮是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗病毒、抗炎、抗癌防癌、防止動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血脂及膽固醇、抗氧化、防衰老等藥理作用[5]。研究表明，藜麥種子含有豐富的黃酮類化合物，具體含量因品種而異，可達(dá)0.36～3.83 mg/g[6-8]。國內(nèi)外報(bào)道了多種關(guān)于黃酮的測定方法，其中可見分光光度法簡單方便，標(biāo)準(zhǔn)對照易得，結(jié)果可靠，是黃酮類化合物定量分析最常用的方法之一[9]。

關(guān)于藜麥黃酮提取工藝的研究已有不少報(bào)道。華艷宏等[7]分別采用不同溶劑提取藜麥種子的黃酮，認(rèn)為70%乙醇是提取藜麥種子黃酮的最好溶劑。陸佳敏等[10]采用3因素3水平正交試驗(yàn)，確定藜麥的最佳提取工藝是乙醇體積分?jǐn)?shù)70%， 提取時(shí)間0.5 h，料液比1∶40（g∶mL），各因素對黃酮提取效率的影響程度依次為提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比。孫雪婷等[11]認(rèn)為各因素對藜麥黃酮提取效率的影響順序?yàn)榱弦罕?浸提時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提溫度，最佳工藝是乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶30（g∶mL），60 ℃水浴溫度下浸提60 min。董晶等[12]研究表明，藜麥種子黃酮的最佳提取條件為料液比1∶50（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間30min。董施彬等[13]研究表明，藜麥種子黃酮的最佳提取工藝為90%乙醇，溫度90 ℃，料液比為1∶10（g∶mL），回流時(shí)間2 h。王丹丹[8]通過單因素試驗(yàn)研究表明，藜麥黃酮提取工藝最佳參數(shù)為80%乙醇、1∶50（g∶mL）料液比、70 ℃提取溫度和60 min提取時(shí)間。上述結(jié)果表明，對于影響藜麥黃酮提取效率的關(guān)鍵因素已基本確定。本研究以青藜2號種子為試驗(yàn)材料，采用正交設(shè)計(jì)方法，探討乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對藜麥黃酮提取含量的影響，旨在確定各因素對藜麥種子黃酮提取效率的影響程度和最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為青海省農(nóng)林科學(xué)院育成的青藜2號，保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。對樣品進(jìn)行去雜，挑選顆粒飽滿的種子，80 ℃烘箱內(nèi)干燥12 h后，用粉碎機(jī)充分粉碎過60目篩，裝入干燥器皿中備用。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

主要試劑包括蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鋁。主要儀器設(shè)備包括電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、研磨儀、分析天平、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 藜麥黃酮提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇影響藜麥種子黃酮提取效率的主要因素，包括乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素為考察因子，根據(jù)前期研究的單因素試驗(yàn)結(jié)果和最適范圍[8]，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～90%，料液比為1∶30～1∶50（g∶mL，下同），提取溫度50～70 ℃，提取時(shí)間為40～60 min，按照L9（34）正交表設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，具體因素和水平見表1。

稱取500 mg藜麥粉末（設(shè)置3次重復(fù)），根據(jù)正交設(shè)計(jì)方案，加入乙醇溶劑，在相應(yīng)的提取溫度下浸提相應(yīng)時(shí)間（具體溫度和時(shí)間見表1），取出冷卻后，6 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定。

1.4 黎麥黃酮含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照陸佳敏等[10]的方法，即稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑5.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇完全溶解后定容至50.0 mL，搖勻，獲得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只10.0 mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，再加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇補(bǔ)至10.0 mL，混勻，以未加入蘆定標(biāo)準(zhǔn)溶液的上述混合溶液為空白對照，于波長510 nm處測定其吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定時(shí)，以樣品提取液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。藜麥黃酮含量計(jì)算公式參考華艷宏等[7]的方法，即黃酮含量（mg/g）=C×V/M，式中，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的質(zhì)量濃度（mg/mL），V為提取液的體積（mL ），M為樣品質(zhì)量（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

各因素對藜麥黃酮提取效率的影響程度采用直觀法分析，處理間的方差分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁在0～0.05 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到回歸方程y=12.23x-0.004（R2=0.999）。該結(jié)果表明，蘆丁在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)吸光度與質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

采用直觀法對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析（表2）。由表2可知，各水平組合對藜麥黃酮含量的影響較大，變幅為0.203～2.536 mg/g。各試驗(yàn)因素中，極差最大的為乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次為提取溫度，再次為料液比，最小為提取時(shí)間，即對藜麥黃酮提取效率的影響程度大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>提取溫度>料液比>提取時(shí)間。綜合各因素的最優(yōu)水平，初步確定藜麥種子黃酮提取的最佳工藝為A3B3C2D1，即90%的乙醇、1∶50的料液比、50 ℃提取50 min。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

為確定藜麥黃酮的最佳提取條件，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度為試驗(yàn)因素，藜麥黃酮含量為指標(biāo)，以3次重復(fù)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（表3）。由表3可知，4個(gè)因素對藜麥黃酮提取含量的影響均達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

多重比較結(jié)果（表4）表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，藜麥黃酮含量升高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%與80%的黃酮含量差異不顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%與90%、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%與90%的黃酮含量差異均達(dá)極顯著水平（P<0.01），且乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)黃酮含量最高。

隨著料液比的增大，藜麥黃酮含量升高，且料液比3個(gè)水平間的黃酮含量差異均達(dá)極顯著水平（P<0.01），其中，料液比為1∶50時(shí)提取的藜麥黃酮含量最高。

隨著提取時(shí)間的增長，藜麥黃酮含量呈先增后減的趨勢，提取時(shí)間從50 min增加至60 min的過程中，提取含量急劇下降，提取時(shí)間3個(gè)水平間的黃酮含量差異均達(dá)極顯著水平（P<0.01），且提取時(shí)間為50 min時(shí)的提取效率最高。

隨著提取溫度的升高，藜麥黃酮含量呈先減后增的趨勢，且60 ℃的提取效率遠(yuǎn)低于50、70 ℃，提取溫度3個(gè)水平間的黃酮含量差異均達(dá)極顯著水平（P<0.01），且50 ℃的提取效率最高。

2.4 最優(yōu)條件的確定

綜合正交試驗(yàn)的直觀分析和方差分析結(jié)果，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度為主要影響因素，料液比和提取時(shí)間影響程度次之，各因素的最優(yōu)水平組合為90%的乙醇、1∶50的料液比、50 ℃提取50 min。

3 小結(jié)與討論

以青藜2號藜麥為試驗(yàn)材料，通過正交設(shè)計(jì)方法，在不考慮互作的條件下，探討了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素對藜麥種子黃酮提取的影響。綜合直觀分析法和方差分析結(jié)果，4個(gè)因素不同水平組合對試驗(yàn)結(jié)果均有顯著影響，在編號2提取條件下，提取的藜麥黃酮含量為（2.536±0.2） mg/g，與編號4的結(jié)果相比，黃酮含量高達(dá)12.5倍，表明通過正交設(shè)計(jì)，探尋最佳提取條件非常有必要。本研究所得最佳提取條件，與孫雪婷等[11]采用熱回流法最佳工藝和響應(yīng)面分析法[14]最佳工藝的黃酮含量相當(dāng)（分別為2.64、2.65 mg/g）。然而，王丹丹[8]同樣以青藜2號為試驗(yàn)材料，采用超聲波法提取藜麥總黃酮，結(jié)果表明，在最佳條件下，青藜2號的黃酮提取含量可達(dá)（3.07±0.09） mg/g，高于本試驗(yàn)提取條件下的黃酮含量，可見，超聲波對藜麥黃酮提取的影響較大，因?yàn)槌暡ㄓ欣诩?xì)胞破碎，進(jìn)而提高了提取效率。

對于乙醇體積分?jǐn)?shù)，部分研究認(rèn)為70%乙醇[10]或80%乙醇對于提取藜麥總黃酮的效果[11，12]為最佳，而本研究表明，70%和80%的乙醇體積分?jǐn)?shù)對結(jié)果的影響未達(dá)顯著水平（P>0.05），90%乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下的黃酮含量極顯著高于70%、80%（P<0.01），與董施彬等[13]的研究結(jié)果相似，推測80%乙醇體積分?jǐn)?shù)是提取黃酮含量顯著提高的分界點(diǎn)，90%以上乙醇體積分?jǐn)?shù)的提取效果如何有待進(jìn)一步探討，然而研究表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高則葉綠素等脂溶性物質(zhì)的溶出量增多，不利于黃酮的提純[15]，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)確定為90%相對較佳。提取時(shí)間對試驗(yàn)結(jié)果的影響較大，特別是從50～60 min，黃酮含量急劇降低，可能是隨著提取時(shí)間的延長，部分黃酮降解[16]和提取液揮發(fā)導(dǎo)致[17]。多數(shù)研究表明，在低溫范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，黃酮提取含量升高，超過一定溫度后，提取含量呈下降趨勢，然而本研究發(fā)現(xiàn)，提取溫度在60 ℃的提取含量極顯著低于50、70 ℃，可能提取溫度與其他因素存在較強(qiáng)的互作。

本研究表明，4個(gè)因素對藜麥黃酮提取含量的影響程度為乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>料液比>提取時(shí)間，與程瑛琨等[18]研究雞骨草和陳偉光等[19]研究葎草總黃酮提取的結(jié)論一致。多數(shù)研究表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取黃酮含量的影響程度高于提取時(shí)間，料液比的影響程度高于提取時(shí)間，但乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的影響程度在不同試驗(yàn)條件下有差異。

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