姜振杰 夏源壯 何 勇*

（大連市第五人民醫(yī)院胸外科，遼寧 大連 116021）

肺癌是最常見的惡性腫瘤，早期肺癌以外科手術(shù)治療為主，患者是否伴有微轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后影響明顯。目前常規(guī)的病理檢測方法及影像學(xué)檢查對(duì)隱匿性的、微小的肺癌轉(zhuǎn)移病灶或亞臨床病灶的檢出率較低[1]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)變化已經(jīng)具備評(píng)估NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的能力，這對(duì)肺癌診療十分重要。KAI1/CD82蛋白存在于上皮細(xì)胞膜中，提示其與腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附力、分化及凋亡有關(guān)[2]。TCF21基因（調(diào)節(jié)正常氣道上皮分化）為抑癌基因之一，非小細(xì)胞肺癌腫瘤中TCF21較正常肺組織明顯低表達(dá)。但是有關(guān)TCF21表達(dá)與NSCLC的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道[3]。PTEN基因?qū)θ橄侔┑榷喾N腫瘤的發(fā)生有影響。但其在NSCLC中的作用相關(guān)報(bào)道卻很少。有研究[4]顯示，細(xì)胞角蛋白（CK）和MUC1是判斷非小細(xì)胞肺癌微轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)志物，同樣有研究顯示淋巴結(jié)中CK20mRNA、MUC1mRNA作為標(biāo)志物診斷可有效判斷其微轉(zhuǎn)移情況。本研究以CK20mRNA、MUC1mRNA作為參照，探討KAI1、TCF21及PTEN與NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，以期為臨床診斷及治療提供幫助與參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2005年1月至2010年12月收治的pN0期NSCLC患者，按5年生存期分為復(fù)發(fā)組[pN0（+）組]，穩(wěn)定組[pN0（-）組]。以CK20mRNA、MUC1mRNA為標(biāo)志物，使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測證實(shí)隨訪5年復(fù)發(fā)組中術(shù)時(shí)存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移者22例（39.29%）作為pN0（+）組；篩選34例（60.71%）5年隨訪穩(wěn)定者作為pN0（-）組。患者中男30例，女26例，年齡41～72歲，平均年齡（52.9±8.90）歲。所有患者均符合國際抗癌聯(lián)盟（UICC）肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)大連市第五人民醫(yī)院病理中心病理學(xué)確認(rèn)和CK20mRNA、MUC1mRNA檢測。

1.2 主要儀器和試劑 RT-PCR引物（上海吉?jiǎng)P合成），DNA marker、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR儀（購自Abcam公司），Anti-TCF21 antibody（GeneTex，美國）、Anti-CD82/KAI1antibody（Novus，美國）、Anti-PTEN antibody（Boster，美國）、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（Beyotime，中國）。

1.3 標(biāo)志物 DNA marker，RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄按照試劑盒操作說明進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 免疫組織化學(xué)方法 脫蠟前，應(yīng)該將組織芯片在室溫中放置60 min或60 ℃恒溫箱中烘烤20 min，組織芯片置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min，無水乙醇中浸泡5 min，抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。高壓熱修復(fù)在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，同時(shí)將玻片置于金屬染色架上，進(jìn)行緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5 min，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10 min后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。按照Allred score評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將免疫組化評(píng)分基于細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分及陽性細(xì)胞比例評(píng)分兩部分。按照切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分為0、1、2分。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，依照每高倍視野陽性細(xì)胞所占比例計(jì)算：1.00%～30.00%、31.00%～75.00%、76.00%～100.00%分別為1、2、3分?？傇u(píng)分為二者乘積，積分為0分表示陰性（-），積分為1～4分表示弱陽性（+），積分大于4分表示強(qiáng)陽性（（++）。陽性表達(dá)率=（弱陽性例數(shù)+強(qiáng)陽性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用（n，%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果（HE×100）

2 結(jié)果

2.1 CK20mRNA、MUC1mRNA檢測pN0期NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移情況分析 經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)以及CK20mRNA、MUC1mRNA檢測，56例pN0期NSCLC患者中淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者22例（39.29%）為pN0（+）組，非淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者34例（60.71%）為pN0（-）組。與pN0（-）組相比，pN0（+）組CK20mRNA、MUC1mRNA水平增高。

2.2 KAI1、TCF21、PTEN免疫組化檢測結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，pN0（+）組基因表達(dá)水平明顯低于pN0（-）組。見圖1。與pN0（-）組患者相比，pN0（+）組患者KAI1、TCF21及PTEN水平明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者KAI1、TCF21及PTEN水平比較

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是一種肺部的惡性腫瘤，是我國常見的腫瘤，癥狀與原發(fā)病灶位置以及轉(zhuǎn)移情況有著密切關(guān)系。目前并未有準(zhǔn)確評(píng)估方法，同時(shí)也缺乏有效的評(píng)估微轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。本研究應(yīng)用CK20mRNA、MUC1mRNA作為標(biāo)志物，檢測pN0期NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移情況，經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)以及CK20mRNA、MUC1mRNA檢測，56例患者中pN0（+）組患者22例（39.29%），pN0（-）組34例（60.71%）。與pN0（-）組相比，pN0（+）組CK20mRNA、MUC1mRNA水平增高。結(jié)果趨勢與既往報(bào)道相符[5]。本研究分析腫瘤抑癌基因KAI1、TCF21及PTEN與NSCLC患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系后發(fā)現(xiàn)，與pN0（-）組患者相比，pN0（+）組患者上述3種基因水平均顯著下降，這提示在NSCLC患者中，KAI1、TCF21及PTEN可能與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)。

KAI1基因在多種腫瘤中存在差異性，容易造成患者腫瘤細(xì)胞黏附力降低，移動(dòng)能力逐漸減弱，逐漸演變?yōu)閻盒粤馨土?。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的KAI1蛋白的表達(dá)幾乎缺失，并由此推測KAI1可能與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。在本次實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，pN0（+）組KAI1蛋白的陽性表達(dá)率下降，提示其表達(dá)下調(diào)可能與NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。TCF21基因在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[7]。研究表明[8]，TCF21在黑色素瘤中能夠上調(diào)KISS-1基因在蛋白中的表達(dá)，從而降低其侵襲能力，其與NSCLC分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本研究中，從TCF21的蛋白表達(dá)角度判斷，認(rèn)為TCF21蛋白的表達(dá)情況對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為有著重要的作用。pN0（+）組患者TCF21蛋白的陽性表達(dá)率顯著下降，提示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加、患者預(yù)后可能較差。PTEN能夠抑制細(xì)胞生長、黏附、轉(zhuǎn)化及遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移起到負(fù)向調(diào)控作用[9]。子宮內(nèi)膜癌的PTEN突變率或缺失率高達(dá)50.00%～83.00%，此外，在胃癌、甲狀腺髓樣癌中，有關(guān)PTEN的研究也顯示其可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，與腫瘤分期密切相關(guān)。但PTEN在NSCLC中的相關(guān)研究卻極為有限。本研究結(jié)果顯示，在pN0（+）組患者中PTEN蛋白的陽性表達(dá)率顯著下降。提示PTEN表達(dá)下調(diào)可能與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，這一結(jié)果與其他惡性腫瘤相關(guān)研究趨勢相符合[10-11]。

綜上所述，本研究從KAI1、TCF21及PTEN的蛋白表達(dá)角度分析，認(rèn)為KAI1、TCF21以及PTEN蛋白的低表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)行為有著重要的作用，并可能預(yù)示肺癌發(fā)生微轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，影響患者預(yù)后，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移具有重要理論及臨床意義。但腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移是多因素作用的結(jié)果，因此，具體相關(guān)機(jī)制還有待繼續(xù)研究探索。