賈佩琦，張嘉琦，蘇東明

0 引 言

結(jié)直腸癌在全球常見癌癥中排名第3位，是導(dǎo)致與癌癥相關(guān)的發(fā)病率和死亡率升高的主要原因之一[1-2]。結(jié)直腸腫瘤早期往往源于結(jié)腸上皮層體積微小的良性腺瘤性息肉，晚期轉(zhuǎn)變?yōu)闃O度分化不成熟的惡性腺瘤，最終隨著時間的推移發(fā)展為侵襲性癌(I期和II期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)[3]。結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制包括遺傳易感性、染色體不穩(wěn)定性、DNA修復(fù)機(jī)制缺陷等。這些因素最終導(dǎo)致多種與腫瘤相關(guān)的基因突變、表觀遺傳改變(如異常的DNA甲基化)、miRNA異常、致癌基因的擴(kuò)增或活性增強(qiáng)、特異性抑癌基因的抑制或失活，從而驅(qū)動與腫瘤發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝途徑[4-6]。

三結(jié)構(gòu)域蛋白21(Tripartite motif 21, TRIM21)最先作為自身抗原被發(fā)現(xiàn)，表達(dá)于各種類型的細(xì)胞，特別是在T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)。TRIM21又稱為 Ro52/SS-A，可以參與固有免疫過程，調(diào)控多種細(xì)胞因子的分泌[7-8]。在干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病的患者常見有TRIM21表達(dá)異常。隨著對其蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)TRIM21具有E3泛素連接酶活性，并且在自噬發(fā)生中也起調(diào)控作用[9-12]。TRIM21既能作為受體、又能招募和組織自噬信號通路的重要分子——ULK1、BECN1、ATG16L1和ATG8[13]。

與整個TRIM蛋白家族的其他亞型相比，涉及TRIM21與結(jié)腸癌相關(guān)機(jī)制的文獻(xiàn)極少。目前研究表明，TRIM21可下調(diào)Par-4水平，對結(jié)腸癌發(fā)生順鉑耐藥起到促進(jìn)作用[14]。而在結(jié)腸癌以外的其他癌癥中，與TRIM21相關(guān)的研究中則有相反趨勢。例如在乳腺癌中，TRIM21介導(dǎo)Snail泛素化，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。TRIM21表達(dá)的降低，提示不良預(yù)后[16]。因此，了解TRIM21的下游分子，也有助于解釋不同癌癥中TRIM21蛋白功能的多樣性。因此，本研究進(jìn)一步研究TRIM21在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能涉及的分子機(jī)制，從而為結(jié)腸癌的診斷治療提供靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑選取2019年10月至2020年4月南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院病理科診斷為結(jié)腸腺癌的20份患者病理標(biāo)本。人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460及人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、SW620購買于美國ATCC公司。FBS胎牛血清購買于中國維森特公司。1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA消化液購買于美國Gibco公司。帶有綠色熒光標(biāo)記蛋白和嘌呤霉素抗性標(biāo)記的TRIM21過表達(dá)慢病毒載體、帶有紅色熒光標(biāo)記蛋白和嘌呤霉素抗性標(biāo)記的干擾TRIM21慢病毒載體由上海吉凱基因公司構(gòu)建。Trizol和qRT-PCR試劑購買于日本Takara公司，qRT-PCR引物購買于上海生工生物工程公司。TRIM21:5′-TCAGCAGCACGCTTGACAAT-3′(F), 5′-GGCCACACTCGATGCTCAC-3′(R)；GAPDH:5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′(F), 5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′(R)。DMSO、TEMED、蘇木素染液、磺酰羅丹明B購買于美國Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購買于美國 Thermo 公司。TRIM21(貨號：12108-1-AP)和內(nèi)參GAPDH抗體(貨號：60004-1-Ig)購買于Proteintech公司，內(nèi)源性過氧化物酶抑制劑、PV8000免疫組化兔/鼠通用二抗、DAB染液購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。青霉素-鏈霉素雙抗購買于中國碧云天公司。其余試劑均購買于中國上海國藥集團(tuán)公司。

1.2方法

1.2.1 免疫組化檢測組織TRIM21表達(dá)采用鏈霉菌生物素-過氧化物酶法(SP法)。染色結(jié)果分別根據(jù)TRIM21的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行評分：陰性0分、弱陽性1分、陽性2分、強(qiáng)陽性3分。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116采用用含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基。慢病毒轉(zhuǎn)染分組：對照組(過表達(dá)空載)、過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染TRIM21過表達(dá)慢病毒)、空載組(低表達(dá)空載對照)、低表達(dá)組(轉(zhuǎn)染TRIM21低表達(dá)慢病毒)。新復(fù)蘇的野生型HCT116細(xì)胞傳至第3代，消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，離心后用完全培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，接種至6孔板中，數(shù)量控制在每孔5×104個細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為30%以上再做轉(zhuǎn)染，病毒感染復(fù)數(shù)值為20；轉(zhuǎn)染72 h后根據(jù)熒光表達(dá)的強(qiáng)度、熒光細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)目的百分比評估感染效率，接種至10 cm培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，以1 μg/ mL終濃度的嘌呤霉素篩選，同時設(shè)置野生型HCT116細(xì)胞設(shè)為篩選對照。待野生型細(xì)胞全部死亡后，以0.6 μg/mL的嘌呤霉素終濃度維持培養(yǎng)，并以96孔板每孔1個細(xì)胞的密度鋪板，擴(kuò)增單克隆細(xì)胞。

1.2.3Western blot檢測結(jié)腸細(xì)胞系TRIM21表達(dá)細(xì)胞總蛋白提取全程在冰上操作。按100∶1混勻蛋白裂解液和PMSF，冰浴備用，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)。待培養(yǎng)細(xì)胞密度足夠時，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍后棄除，滴加準(zhǔn)備好的蛋白裂解混合液，與細(xì)胞充分接觸后用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮致完全脫落。將得到的細(xì)胞懸浮液移入1.5 mL的EP管中，冰浴靜置15～20 min，離心、取上清，BCA法測定蛋白濃度后，加6×loading buffer，95 ℃煮樣10 min。使用5%濃縮膠、10%分離膠SDS-PAGE電泳分離蛋白，恒流180 mA轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)印后PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2～2.5 h，孵育抗工作液(TBST按TRIM21 1∶800、GAPDH 1∶8000稀釋),4 ℃搖床過夜；TBST洗膜15 min，3遍；孵育二抗工作液(TBST按1∶8000稀釋)，室溫60 min；TBST洗膜15 min，3遍后現(xiàn)配ECL超敏發(fā)光液顯影。

1.2.4磺酰羅丹明B法檢測細(xì)胞增殖使用上述分組進(jìn)行實驗。消化處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，2500個/孔接種至96孔板；分別在24 h、48 h、72 h和96 h收取96孔板，吸去培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌1次；每孔加入200 μL的50%濃度TCA固定液，4 ℃固定60 min；棄去固定液，用去離子水清洗5遍，放置于37 ℃烘箱烘干，或于通風(fēng)櫥晾干；每孔加4 g/L SRB溶液100μL，放置于室溫染色15 min；10 mL/L乙酸(1%)輕洗5次，晾干；每孔加10 mmol Tris-base(pH=10.5)100 μL，在平板振蕩5 min；使用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm的吸光度值，以空白對照調(diào)零；根據(jù)吸光度值加權(quán)差值計算細(xì)胞增殖率。

1.2.5集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖使用上述分組進(jìn)行實驗。消化處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后以500個/孔接種于6孔板中，使細(xì)胞分散均勻，放于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周；經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，隨即終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次；4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 mL固定15 min。去固定液，加適量GIMSA液色10～30 min，流水緩慢清洗，通風(fēng)櫥內(nèi)干燥。倒置平皿并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，肉眼直接計數(shù)克隆，或于低倍顯微鏡計>20個細(xì)胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕视嬎愎饺缦拢?/p>

克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%

1.2.6劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移使用上述分組進(jìn)行實驗。用尖頭記號筆于6孔板背后，每間隔0.5～1 cm沿直尺均勻劃橫線，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；每孔接種約5×105個細(xì)胞，具體數(shù)量取決于細(xì)胞種類，接種原則為過夜后融合率達(dá)到90%以上；第2天用槍頭沿直尺垂至于馬克筆標(biāo)記劃痕；每孔0.5 mL PBS輕柔洗細(xì)胞3次，去處劃痕處懸浮細(xì)胞，加入低血清培養(yǎng)基(< 2% FBS)放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，在劃痕后0 h、24 h和48 h取樣，拍照；使用Image J圖像處理軟件獲取細(xì)胞間距離的均值，根據(jù)變化計算細(xì)胞遷移率。

1.2.7RNA測序分別提取空載組及低表達(dá)組的HCT116細(xì)胞總RNA后，用帶有 Oligo(dT)的磁珠富集 mRNA，加入Fragmentation buffer 使其片斷成為短片段，再以片斷后的 mRNA 為模板，合成 cDNA 第一鏈、第二鏈，經(jīng)末端修復(fù)、加堿基 A、測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，完成文庫制備。文庫上機(jī)用 Illumina HiSeqTM進(jìn)行測序。對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、組裝轉(zhuǎn)錄本，得到已知的轉(zhuǎn)錄本與新的轉(zhuǎn)錄本。對基因進(jìn)行表達(dá)量分析與統(tǒng)計，并進(jìn)行差異表達(dá)分析和功能富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 TRIM21在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)的比較TRIM21表達(dá)于結(jié)腸上皮組織及肌層的細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核，見圖1。結(jié)腸癌患者癌組織中TRIM21免疫組化評分(2.700±0.250)明顯高于癌旁組織(2.500±0.346)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW620中TRIM21的表達(dá)(1.443±0.108、2.413±0.526、1.453±0.154)高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460(1.000±0.000)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

T：腺體異型的結(jié)腸癌組織； N：癌旁腺體結(jié)構(gòu)分化基本正常的腺體

1:人正常結(jié)腸細(xì)胞系; 2-4:人結(jié)腸癌細(xì)胞系

2.2TRIM21過表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞株的Western blot驗證選取TRIM21基礎(chǔ)表達(dá)量處于結(jié)腸細(xì)胞系平均水平的細(xì)胞系HCT116，慢病毒轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot驗證，結(jié)果見圖3。與對照組TRIM21相對蛋白表達(dá)量(0.639±0.106)相比，過表達(dá)組(1.531±0.108)明顯升高(P<0.001)。低表達(dá)組TRIM21的蛋白表達(dá)量(0.293±0.063)較空載組(0.640±0.083)明顯降低(P<0.001)。上述結(jié)果表明在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中成功構(gòu)建了TRIM21穩(wěn)定過表達(dá)(TRIM21 OE)及穩(wěn)定低表達(dá)(TRIM21 KD)模型，后續(xù)TRIM21表型實驗皆采用此模型。

1:對照組; 2:過表達(dá)組; 3:空載組; 4:低表達(dá)組

2.3TRIM21在體外對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖能力的影響SRB細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，在48 h、72 h和96 h，過表達(dá)組的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞生長能力較對照組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。低表達(dá)組HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞生長能力較空載組明顯降低(P<0.05)，說明TRIM21穩(wěn)定低表達(dá)致結(jié)腸癌細(xì)胞生長受抑制，見表1。集落形成實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)組集落個數(shù)(446.667±75.719)較對照組(283.333±20.817)明顯增加(P<0.05)。低表達(dá)組集落個數(shù)(413.667±81.070)較空載組(442.537±98.063)明顯減少(P<0.05)，結(jié)腸癌細(xì)胞生長受抑制。見圖4。

表 1 磺酰羅丹明B法檢測細(xì)胞增殖的比較

圖 4 集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖結(jié)果

2.4TRIM21在體外對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116遷移能力的影響24、48 h，過表達(dá)組結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力較對照組組明顯增強(qiáng)(P<0.01)，低表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力較空載組顯著減弱(P<0.01)。見圖5，表2。

圖 5 TRIM21對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響

表 2 各組結(jié)腸癌細(xì)胞遷移率的比較

2.5TRIM21對下游分子的調(diào)控與空載組比較，低表達(dá)組在mRNA水平下調(diào)COX7A2L、KBTBD7、RAD51AP1、C2orf69等分子的表達(dá)，上調(diào)KRT7、TMEM158、TACSTD2、MAZ等分子的表達(dá)。對測序結(jié)果提示的TRIM21下游分子進(jìn)行功能分析，TRIM21與中性粒細(xì)胞激活、橫紋肌發(fā)育、類固醇激素反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)受體信號通路、細(xì)胞對非生物刺激反應(yīng)、細(xì)胞對環(huán)境刺激反應(yīng)、成骨細(xì)胞分化、細(xì)胞連接形成、胎盤發(fā)育、NADH再生及代謝、葡萄糖分解代謝過程、RNA聚合酶II基因轉(zhuǎn)錄、著絲粒形成存在功能相關(guān)性，見圖6。

a：TRIM21 RNA測序火山圖；b：功能氣泡圖

3 討 論

TRIM蛋白家族主要通過N端的RING-finger結(jié)構(gòu)域被賦予E3泛素連接酶的功能，TRIM5α、TRIM9、TRIM3、TRIM28、TRIM27和TRIM37等均被報道具有E3泛素連接酶活性[17]。N端除RING-finger結(jié)構(gòu)域之外，還有1-2個被命名為B-box的Zinc-finger結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域。除此之外，C端還有PRY、SPRY、COS、FNIII、ACID等結(jié)構(gòu)域。不同結(jié)構(gòu)域之間的功能有所區(qū)別。

TRIM21參與固有免疫，調(diào)控多種細(xì)胞因子的分泌。而TRIM21的異常表達(dá)常常出現(xiàn)在干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病發(fā)生時。同時，目前的研究已經(jīng)證實TRIM21在多種癌癥中存在異常表達(dá)，在不同的癌癥中有雙向功能。在乳腺癌中，TRIM21表達(dá)的降低，會促進(jìn)癌細(xì)胞生長，提示不良預(yù)后[16]；另有文獻(xiàn)表明，TRIM21介導(dǎo)Snail泛素化，調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。

腫瘤抑制劑前列腺凋亡反應(yīng)蛋白4(Par-4)在多種腫瘤中能誘導(dǎo)選擇性凋亡，是公認(rèn)的腫瘤抑制劑。TRIM21可通過C端的PRY-SPRY結(jié)構(gòu)域與Par-4發(fā)生結(jié)合并下調(diào)Par-4，從而抑制癌細(xì)胞的選擇性凋亡，最終增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性[14]。帶著“在結(jié)腸癌發(fā)生過程中，TRIM21是否真的扮演一個促癌因子”的疑問，展開對臨床標(biāo)本和細(xì)胞系的研究。本研究中，選取20例臨床病例結(jié)腸癌及癌旁石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)TRIM21在結(jié)腸癌組織的表達(dá)高于癌旁組織。在對結(jié)腸上皮細(xì)胞的研究中，通過對正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460及結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、SW620的Western Blot實驗，證實TRIM21在結(jié)腸癌細(xì)胞的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸細(xì)胞。HCT116、HT29均是從人結(jié)腸癌中分離得到的細(xì)胞系，HCT116與HT29相比具有較強(qiáng)的干細(xì)胞特性(CD44+/CD24-)；而SW620為人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)后提取到的細(xì)胞。

為了探究TRIM21對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移的影響，本研究選取內(nèi)生性TRIM21表達(dá)處于結(jié)腸癌細(xì)胞系中等水平的細(xì)胞系HCT116，分別構(gòu)建了TRIM21穩(wěn)定過表達(dá)(TRIM21 OE)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株、TRIM21穩(wěn)定低表達(dá)(TRIM21 KD)細(xì)胞株以及各自的空載對照細(xì)胞株(NC、shNC)。細(xì)胞增殖實驗、集落形成實驗證實，分別與各自對照組相比，外源性過表達(dá)TRIM21顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖；shRNA敲低TRIM21顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖。劃痕實驗表明，分別與各自對照組相比，外源性過表達(dá)TRIM21對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的遷移能力起顯著促進(jìn)作用；shRNA敲低TRIM21對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的遷移能力起顯著抑制作用。

為了從轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)一步研究TRIM21的功能，揭示TRIM21在結(jié)腸癌發(fā)生過程中的分子機(jī)制，RNA測序篩選出了潛在的COX7A2L、KBTBD7、RAD51AP1、C2orf69、 KRT7、TMEM158、TACSTD2、MAZ等下游分子，推測TRIM21與中性粒細(xì)胞激活、橫紋肌發(fā)育、類固醇激素反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)受體信號通路、細(xì)胞對非生物刺激反應(yīng)、細(xì)胞對環(huán)境刺激反應(yīng)、成骨細(xì)胞分化、細(xì)胞連接形成、胎盤發(fā)育、NADH再生及代謝、葡萄糖分解代謝過程、RNA聚合酶II基因轉(zhuǎn)錄、著絲粒形成等諸多生物功能相關(guān)。以上結(jié)果與TRIM21促結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生的文獻(xiàn)報道結(jié)果[14]相符，也為研究TRIM21參與調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及功能提供了方向。