萬宇平 何方洋 賈芳芳 崔娜 崔海峰

摘 要：本文通過制備滴滴涕半抗原，研制出一種能夠檢測蔬菜、水果、飼料、牛奶中滴滴涕的膠體金免疫層析試紙條，檢測限為5μg/kg，檢測時間為15min，假陽性率和假陰性率均為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求。同時，該試紙條可用于基層實驗室的大批量樣本檢測，具有實際意義，且未見免疫方法相關文獻報道，具有創(chuàng)新性。

關鍵詞：滴滴涕? 膠體金免疫層析試紙條? 快速檢測

引言

滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，簡稱“DDT”）是一種高毒有機磷殺蟲劑，其應用廣泛，因對害蟲有觸殺、胃毒等作用而被用于防治蚊蠅和臭蟲[1-3]。由于該藥物化學性質較為穩(wěn)定，容易富集污染環(huán)境，并可通過食物鏈進入人體而危害健康。因此，早在2009年，我國就已全面禁止了滴滴涕的生產、使用和進出口。但時至今日，仍有部分養(yǎng)殖戶使用滴滴涕作為殺蟲劑，故對該農藥殘留進行檢測具有必要性[4-6]。

目前，檢測滴滴涕的方法大多為儀器方法[7-14]，但此類方法成本較高、檢測時間長、操作復雜，不符合基層實驗室高效、便捷的檢測要求。因此，本研究制備出一種滴滴涕的單克隆抗體，將其應用于膠體金免疫快速檢測試紙條，可實現高效、便捷的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等標準品（純度≥95%），購自北京標準物質研究中心;檸檬酸三鈉、碳酸鉀，購自北京百欣試劑公司;樣本提取劑、樣本復溶液、膠體金分析儀，由北京勤邦生物技術有限公司提供;渦旋儀、均質器，購自湖南湘立科學儀器有限公司[15-16]。

1.2 方法

1.2.1 滴滴涕半抗原的制備

取1.7g鄰氯苯乙酸，加5mL氯苯，再加入1.8g水合氯醛，加熱至完全溶解后，加入三氯化鋁5.38g，室溫攪拌5h，停止反應，加水80mL和乙酸乙酯120mL，萃取分離，分去水相，有機相無水硫酸鈉干燥蒸干，得到黃色油狀物，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯（v/v，1/1）洗脫分離，得到乙酸滴滴涕半抗原產物1.8g，收率43.9%。

1.2.2 免疫原的制備——滴滴涕半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產物15mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC13.7mg和NHS10.9mg，充分混勻后，反應4h，得到半抗原活化液A液;取牛血清白蛋白（BSA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液。將A液滴加到B液中，4℃反應24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-BSA偶聯物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.3 免疫原的制備——滴滴涕半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產物9mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC7.6mg和NHS6.8mg，充分混勻后反應4h，得到半抗原活化液A液;取卵清白蛋白（OVA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液。將A液滴加到B液中，4℃反應24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-OVA偶聯物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.4 將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍干到微孔試劑上

將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物加入到微孔板中，冷凍干燥，得到滴滴涕單克隆抗體-膠體金標記物凍干的微孔試劑[15-16]。

1.2.5 檢測方法

向微孔中加入100μL待檢樣本溶液，混勻，室溫下培育3min。吸取70μL溶液滴至試紙條上，反應10min，根據示意圖判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果[15-16]。

1.2.6 樣本檢測限

在空白蔬菜、水果、飼料、牛奶樣本中分別添加滴滴涕標準品至質量濃度為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L，按照“1.2.5”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據實驗結果確定樣本檢測限[15-16]。

1.2.7 試紙條的特異性

分別配制500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，用膠體金免疫快速檢測試紙條進行檢測，重復測定3次，判斷試紙條的特異性[15-16]。

1.2.8 準確性

農業(yè)部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準確性[15-16]。取經過儀器確證的50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度小于5μg/kg）與50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度大于5μg/kg），用膠體金免疫快速檢測試紙條檢測滴滴涕的殘留量，計算假陽性率和假陰性率[15-16]?！掇r殘辦技術材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應小于5%，假陰性率應為零[15-16]。

1.2.9 試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條保存于2～8℃環(huán)境中，每隔1個月檢測試紙條的準確性，連續(xù)測定15個月[15-16]。具體方法為：分別檢測經過儀器確證的20份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度小于5μg/kg）與20份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質量濃度大于5μg/kg），重復測定2次，根據實驗結果判定試紙條的穩(wěn)定性[15-16]。

2 結果與分析

2.1樣本檢測限

配置滴滴涕濃度分別為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，按照“1.2.5”步驟進行檢測，確定檢測限[15-16]。結果顯示，該試紙條的檢測限為5μg/kg，見表1。

2.2 特異性

用試紙條檢測500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，結果均呈陰性（見表2），表明該試紙條特異性較好[15-16]。

2.3 準確性

用試紙條檢測50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測結果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用試紙條檢測50份陽性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測結果均為陽性（見表3），說明該試紙條假陰性率為零，符合《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求[15-16]。

2.4 穩(wěn)定性

試紙條保存12個月內，其假陽性率和假陰性率的檢測結果均符合要求;之后試紙條會出現少量失效、假陰性等現象[15-16]（見表4）。

3 討論

目前，有關檢測滴滴涕的文獻較為有限，本研究通過制備滴滴涕半抗原，讓其與載體蛋白偶聯得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，對試紙條進行了特異性、準確性、穩(wěn)定性等性能測試，均符合要求。此外，該試紙條的檢測時間僅為15min，比現有文獻中儀器方法用時更短，操作更簡便。

參考文獻：

[1] 付善良，陸靜，陳練，成婧，朱紹華，羅芳，符瓊，易錫，梁香.磁固相萃取-熱脫附-氣相色譜-串聯質譜檢測水中六氯苯、六六六和滴滴涕[J].環(huán)境化學，2020，39（02）：566-568.

[2] 關晨晨，潘碧樞，陳淅.氣相色譜-串聯質譜法測定灘涂生物樣本中的六六六和滴滴涕[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2020，30（05）：537-539+550.

[3] 孫曉杰，丁海燕，李兆新，盧立娜，邢麗紅，譚志軍，翟毓秀.氣相色譜–電子捕獲檢測法測定食品中有機氯類和擬除蟲菊酯類農藥殘留量[J].食品安全質量檢測學報，2019，10（21）：7283-7289.

[4] Huang Xiaodong，Liu Yanan，Liu Huifang，Liu Guangyang，Xu Xiaomin，Li Lingyun，Lv Jun，Liu Zhongxiao，Zhou Wenfeng，Xu Donghui. Magnetic Solid-Phase Extraction of Dichlorodiphenyltrichloroethane and Its Metabolites from Environmental Water Samples Using Ionic Liquid Modified Magnetic Multiwalled Carbon Nanotube/Zeolitic Imidazolate Framework-8 as Sorbent.[J]. Molecules （Basel， Switzerland），2019，24（15）.

[5] 劉寶貴，劉哲.食品中六六六和滴滴涕殘留量檢測方法的改進[J].呂梁教育學院學報，2018，35（03）：31-35.

[6] 劉維英.食品中六六六、滴滴涕殘留量的測定[J].現代食品，2018（14）：91-94.

[7] 趙微.毛細管柱氣相色譜法測定六六六、滴滴涕[J].科技風，2018（08）：81-82.

[8] 谷勇，唐文麗，羅成，侯杰榮.GC-ECD檢測馬齒莧中六六六和滴滴涕的農藥殘留[J].中國民族民間醫(yī)藥，2018，27（04）：25-27.

[9] 任興權，任璐.食品中六六六和滴滴涕檢測方法的優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（01）：136-140.

[10] 王潔櫻.邯鄲市表層土壤與蔬菜中六六六（HCHs）和滴滴涕（DDTs）殘留量的檢測研究[J].當代化工研究，2017（05）：146-147.

[11] 劉丹丹，何飛飛，張艷，郝淑美.云南小?？Х戎辛⒌蔚翁闅埩袅繙y定適宜方法研究[J].現代農業(yè)科技，2016（20）：94-95.

[12] 翁飛智.茶葉中六六六、滴滴涕農藥殘留檢測[J].江西農業(yè)，2016（13）：9-10.

[13] 劉海萍，魯炳聞，房麗萍，楊剛，田衎，封躍鵬.含13種有機氯農藥土壤標準樣品的研制[J].化工環(huán)保，2016，36（01）：110-114.

[14] 王乙震，羅陽，齊向華，張俊，林超.固相萃取-氣相色譜三重串聯四級桿質譜法測定海河流域地下水中六六六和滴滴涕[J].海河水利，2015（06）：17-20.

[15] 吳小勝，賈芳芳，崔海峰，等.一種苯醚氰菊酯膠體金免疫快速檢測試紙條的研制[J].湖北農業(yè)科學，2020，59（7）：196-198，203.

[16] 朱亮亮，王琳琛，王兆芹，崔海峰，張坤，馮才偉，萬宇平.檢測4種有機磷農藥膠體金免疫層析試紙條的研制[J].山東畜牧獸醫(yī)，2019，40（08）：10-12.