王 磊 王魯霞 劉延平 朱 輝 陶相錦

菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 山東菏澤 274000

雞蛋作為一種廉價優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源，保障了我國居民飲食結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)的基本需求。2017年我國雞蛋產(chǎn)量已達(dá)到2 609.5萬t，位居世界首位[1]。目前我國允許使用于產(chǎn)蛋期蛋雞中的抗生素種類比較少，由于氯霉素藥物對人體健康有嚴(yán)重的毒副作用，能抑制骨髓造血機(jī)能，引起人的再生障礙性貧血等疾病[2]，已禁止在食用源性動物產(chǎn)品上使用。而氟苯尼考作為氯霉素的衍生物，是一種新型的酰胺醇類廣譜抗生素，它具有抗菌譜廣、安全高效等特點(diǎn)，氟苯尼考已替代氯霉素藥物的應(yīng)用[3]。有研究報道表明，氟苯尼考可用于雞治療敏感細(xì)菌所致的細(xì)菌性感染，尤其對于雞金黃色葡萄球菌感染治療效果明顯[4]。氟苯尼考相對于氯霉素和甲砜霉素毒性較低，但對哺乳動物具有胚胎毒性，長期食用含有氟苯尼考及其代謝物的動物源食品將會對人體產(chǎn)生嚴(yán)重的安全隱患[5]。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定，氟苯尼考在雞肉中的最高殘留限量(MRL)不得超過100μg/kg，在家禽的肝臟、腎臟中的最高殘留限量分別不得超過2 500、750μg/kg，而在蛋制品中不得檢出。因?yàn)榉侥峥紩p度抑制生殖激素的產(chǎn)生，造成雞蛋早期胚胎的死亡，因此蛋雞產(chǎn)蛋期禁用。濫用氟苯尼考會引起動物性食品獸藥殘留，進(jìn)而可能對人類健康產(chǎn)生危害，以及致病菌株耐藥性的產(chǎn)生。目前，檢測動物組織中氟苯尼考?xì)埩舻姆椒ㄖ饕庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)[6～10]等。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性定量準(zhǔn)確，靈敏度高，不需要衍生化，抗干擾能力強(qiáng)，故為理想的氟苯尼考?xì)埩袅糠治龇椒╗11]。有研究考察了反復(fù)凍融對畜禽肉品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)凍融次數(shù)增加,膽固醇含量逐漸降低，膽固醇氧化物的含量先逐漸增加，后趨于平穩(wěn)[12]。探究凍融循環(huán)對水產(chǎn)品肌肉蛋白pH值影響，其呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與肌肉品質(zhì)密切相關(guān)[13]。而凍融處理對于氟苯尼考含量的影響未有研究。

本試驗(yàn)研究了凍融處理對檢測雞蛋中氟苯尼考含量的影響，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的準(zhǔn)確度和精密度能滿足藥物殘留檢測限量的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心提供，批號：8003，濃度100μg/mL。用甲醇溶解配制成濃度為1.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液，臨用時準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備，液用流動相稀釋成適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

化學(xué)試劑：乙腈，甲醇，色譜純；甲酸，分析純；所有試劑均用超純水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀TQ-MS，Waters公司；

電子分析天平ME204，METTLER TOLEDO公司；

高速冷凍離心機(jī)3K15，德國SIGMA公司；

數(shù)控超聲波清洗器KQ-500DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

固相萃取裝置，Waters公司；

氮?dú)獯蹈蓛xOA-HEAT型，Organomation公司；

多管漩渦混合儀HD-2500型，杭州佑寧儀器有限公司；

具塞塑料離心管；

有機(jī)相針式濾器(0.25μm)；

HLB固相萃取柱Oasis Prime HLB 6 cc/200 mg，Waters公司；

200μL、1mL移液槍，Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜操作條件及質(zhì)譜條件

色譜柱參數(shù)：Acquity UPLC BEN C18(2.1mm×100mm，粒徑1.7μm)。

流動相：0.1%甲酸/水溶液為A相，乙腈為B相，流動相初始比例為水∶乙腈=50∶50(V/V)。線性梯度洗脫(0～1min，50%B→50%B；1～1.5min，50%B→90%B；1.5～2min，90%B→90%B；2～2.1min，90%B→50%B；2.1～5min，50%B→50%B)。

流速：0.3mL/min。

柱溫：40℃。

進(jìn)樣體積：5μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI)。

掃描方式：負(fù)離子掃描。

監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

毛細(xì)管電壓：3 000V。

離子源溫度：350℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精確量取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液1mL，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液；然后用0.1%甲酸/乙腈/水溶液(90+10)依次稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作(如圖1)：按濃度由小至大的順序，用微量注射器依次注入5μL的0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，按色譜操作條件，用HPLC-MS/MS檢測，得到色譜圖，峰面積及保留時間，并計(jì)算其線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)。計(jì)算可得，氟苯尼考在線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.9949，符合要求范圍。

圖1 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig. 1 Fluorfenicol standard curve

1.3.3 樣品的提取凈化步驟

(1)提取。

將取自同一檢驗(yàn)批次的10枚雞蛋樣品制成勻漿。準(zhǔn)確稱取2.00g樣品勻漿，置于50mL聚丙烯離心管中，加入10mL 80%乙腈和20%水混合液，渦旋振搖2min，超聲波提取15min，再渦旋提取2min后，以8 000r/min離心15min，吸取上清液待凈化。

(2)凈化。

用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化。HLB固相萃取柱為親水親脂平衡的水可浸潤性的反相吸附劑，不影響吸附劑床的干涸，無須活化，直接上樣，可對氯霉素類藥物進(jìn)行選擇吸附，有效去除樣品中的基質(zhì)干擾物，對蛋樣基質(zhì)能達(dá)到較好的凈化效果。取上述提取的上清液過柱，控制流速不超過1.0mL/min。洗脫液于45℃用氮?dú)獯蹈?，濃縮物用1mL 0.1%甲酸/乙腈/水溶液(90+10)溶解，渦旋混合1min，超聲波混合15min，再渦旋混合1min，0.25μm微孔濾膜過濾，濾液用于HPLC-MS/MS檢測。取濾液5μL注入色譜柱，記錄氟苯尼考的峰面積。

1.3.4 樣品回收率測定

樣品回收率測定。稱取5份雞蛋樣品勻漿，每份2.00g，置于50mL聚丙烯離心管中，分別加20、40、60、100μL的100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)上述方法提取和凈化，進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測，求得氟苯尼考在2、4、6、10ng/g水平上的雞蛋樣品回收率。

1.3.5 起泡性測定

用量筒量取100mL蛋液樣品倒入500mL燒杯中，每個溫度下制備3個平行組，并在測量前進(jìn)行凍融循環(huán)處理。靜置后置于-18、4、25℃環(huán)境條件下，12h后取出，在室溫條件下解凍放置12h，此為1次凍融循環(huán)。將打蛋機(jī)攪拌棒置于燒杯中，均勻打發(fā)90s，測量泡沫和液體的體積。起泡性的計(jì)算如公式(1)：

(1)

1.3.6 析水率測定

將所制備的雞蛋液，攪拌均勻，取5g倒入離心管中，將凍融處理后離心管中的樣品在8 000r/min條件下離心15min，棄去上清液，稱取沉淀物質(zhì)量，計(jì)算析水率，利用析水率表征蛋液凍融穩(wěn)定性，根據(jù)公式(2)計(jì)算析水率：

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

利用UPLC節(jié)省了分析時間，但UPLC載樣量小，要求使用三重四極桿質(zhì)譜掃描時能夠達(dá)到最佳的靈敏度，由于食品基質(zhì)復(fù)雜，故選擇載樣量和分離度適當(dāng)，粒徑為1.7μm的色譜柱。以獲得對稱尖銳的峰形為目標(biāo)，分別考察了不同配比的流動相和不同有機(jī)相增速的分離效果，考察流動相能否滿足物質(zhì)的分離和峰形要求。計(jì)算樣品回收率可知，本實(shí)驗(yàn)關(guān)于氟苯尼考的處理方法計(jì)算出的回收率都在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)，操作合乎規(guī)范。

對于不同有機(jī)相配比流動相對氟苯尼考TIC總離子流圖的影響如圖2所示。在相同的流速條件下，不同有機(jī)相配比的流動相對氟苯尼考的出峰時間影響較大，隨著有機(jī)相配比的增大，氟苯尼考的出峰時間總體呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢。如表1所示在60%～80%的變化過程中，出峰時間從1.92min增大到2.78min。在80%～90%的變化過程中，出峰時間從2.78min變化到2.24min，當(dāng)有機(jī)相配比為80%時，標(biāo)樣的出峰時間最長，之后則隨著有機(jī)相配比的增大而減小。出峰時間在前期出現(xiàn)了增加的現(xiàn)象，可能是有機(jī)相增多所導(dǎo)致氟苯尼考在色譜柱上的保留增大的緣故。其中，隨著有機(jī)相比例升高，氟苯尼考的峰形變寬。氟苯尼考的峰形對流動相比例的變化較為敏感，過高或者過低的有機(jī)相配比所出峰形更尖銳，而在90%有機(jī)相配比的條件下，氟苯尼考的含量最大。在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)相比例條件下，氟苯尼考也會出現(xiàn)對稱、尖銳的單峰，見圖3所示。

圖2 不同配比流動相的影響Fig. 2 Influence of mobile phase with different proportions

表1 不同配比流動相條件下的參數(shù)Table 1 Parameters of mobile phase with different proportions

圖3 流動相時間梯度的影響Fig. 3 Influence of time gradient of mobile phase

同時對有機(jī)相增速進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)，在隨著有機(jī)相流速的增大，氟苯尼考的保留時間未受影響，而氟苯尼考的檢測含量隨著乙腈流速的增大出現(xiàn)先增大而后減小的變化趨勢，且在1.5min時，檢測含量達(dá)到最大(見表 2)，說明過高的有機(jī)相流速不利于氟苯尼考在柱子上的保留，使得檢測含量偏低，氟苯尼考更適合流速適中的有機(jī)相，而不同的增速都能夠得到峰形尖銳的總離子流圖。

表2 不同流動相時間梯度條件下的參數(shù)Table 2 Parameters under different time gradients of mobile phase

2.2 凍融對氟苯尼考含量的影響

凍融溫度和周期對蛋液中氟苯尼考含量的影響如圖4所示。

圖4 凍融溫度和周期對氟苯尼考含量的影響Fig. 4 Effects of freeze-thaw temperature and cycle on the content of fluphenicol

對比不同溫度條件下氟苯尼考的含量變化，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過凍融處理的蛋液中氟苯尼考的含量較高，這可能是因?yàn)榈蜏氐拇鎯^程中，存在著蛋白質(zhì)變性和水分減少2個競爭的過程[14]。經(jīng)過凍融處理，蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)被破壞，氟苯尼考分子可能與蛋白質(zhì)存在分子對接關(guān)系，這種相互關(guān)系的破壞使得氟苯尼考檢測含量的下降。全蛋液經(jīng)1次凍融循環(huán)后，對應(yīng)氟苯尼考的含量顯著下降。有研究發(fā)現(xiàn)，冷凍時間超過5h后，蛋清液從水分減少占優(yōu)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)變性占優(yōu)，蛋清和全蛋粘度下降[15]。全蛋液包括蛋清和蛋黃，而蛋黃在冷凍后低密度脂蛋白的水化層由于冰晶的形成而被破壞，可改變其分子折疊的程度[16]。而之后的凍融處理過程中，氟苯尼考含量的變化不再明顯。表明對于全蛋蛋液，凍融處理能在一次處理后顯著降低氟苯尼考的檢出含量，凍融對氟苯尼考含量的影響較大。但對于不同的處理溫度，發(fā)現(xiàn)在室溫條件下，氟苯尼考存在自然降解的過程。但總體而言，凍融溫度的影響要大于凍融周期的影響。

2.3 凍融對蛋液起泡特性的影響

起泡性指蛋白質(zhì)在一定條件下生成泡沫的能力[17]。凍融處理對雞蛋蛋液起泡特性的影響變化見圖5。

圖5 凍融溫度和周期對蛋液起泡特性的影響Fig. 5 Effects of freeze-thaw temperature and cycle on foaming characteristics of egg liquid

由圖5可知，在整個凍融周期內(nèi)，-18℃條件下儲藏的蛋液起泡性，隨著儲藏時間的延長變化最顯著，起泡性呈遞減的趨勢，起泡性起始值為133.2%，經(jīng)過一次凍融處理后，起泡率變?yōu)?0.9%，之后開始出現(xiàn)逐漸降低的趨勢；4℃和25℃儲藏的鮮蛋起泡性也呈下降的趨勢，但與-18℃條件下的變化相比較而言，變化較為平緩。且25℃和4℃貯藏起泡性隨凍融處理周期的增長一直高于-18℃貯藏的蛋清液樣品。這是因?yàn)?，溫度升高有利于蛋清起泡性的提高，表面張力會隨著溫度的升高而下降，更有利于樣品形成泡沫[18]。

對雞蛋液起泡性此前已有大量研究。發(fā)現(xiàn)在蛋液攪打的過程中，通過外界的作用力將蛋清蛋白的球型分子構(gòu)造打破，折疊的蛋白分子打開，使其分子中的羧基、氨基、巰基、肽鍵等活性基團(tuán)裸露出來。同時，疏水基團(tuán)暴露，界面張力降低，并將空氣混入蛋液中與疏水基團(tuán)結(jié)合，使泡沫體積迅速上升[19]。在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，越有利于泡沫的形成。但常溫條件下，蛋白層的組成比例將發(fā)生顯著變化[20]，微生物繁殖，蛋清液pH值下降，又會對蛋清液的起泡性產(chǎn)生影響[21]。而較低的溫度時，由于線形蛋清蛋白分子鏈取向在水分子凍結(jié)的作用下而被破壞，暴露出的活性基團(tuán)數(shù)也會相應(yīng)的減少，所形成的包裹著空氣的致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得不再穩(wěn)定，相應(yīng)的氣泡率降低。

2.4 凍融對蛋液析水率的影響

圖6為經(jīng)過攪打的蛋液在不同凍融循環(huán)周期的析水率變化。

圖6 凍融溫度和周期對蛋液析水率的影響Fig. 6 Effects of freezing and thawing temperature and cycle on water leaching rate of egg liquid

凍融穩(wěn)定性主要通過反復(fù)凍融后測定基體析水率來反映的。析水率越低，表明凍融穩(wěn)定性越好。由圖6可知，蛋液在經(jīng)過不同貯藏溫度的處理后，經(jīng)1次凍融循環(huán)，對應(yīng)-18℃處理的蛋液析水率明顯低于4℃和25℃實(shí)驗(yàn)組，-18℃低溫貯藏的蛋液樣品的析水率迅速下降至45.8%。這主要是因?yàn)椋?18℃條件下析水率的變化最為顯著，在-18℃條件下，水分經(jīng)歷了由液態(tài)水分子到凍結(jié)態(tài)的轉(zhuǎn)變。低溫凍結(jié)后的蛋白結(jié)構(gòu)與水分子的束縛性變強(qiáng)，這也與其對應(yīng)起泡性的變化趨勢一致。然而，當(dāng)進(jìn)行第3次凍融循環(huán)后，-18℃處理實(shí)驗(yàn)組水分幾乎沒有析出，而4℃和25℃處理實(shí)驗(yàn)組析水率仍然保持在70%左右。多次低溫凍融循環(huán)后，其凍融穩(wěn)定性逐漸變差。較低的溫度或較多的凍融周期，都會導(dǎo)致析水率的降低，這是由于凍融周期越長，或溫度越低，蛋清蛋白分子結(jié)構(gòu)被破壞的程度越大。在25℃溫度條件下，凍融周期的不同階段，析水率保持在67.8 %左右。

全蛋液很容易出現(xiàn)脫水的現(xiàn)象，這可能和其微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。對于蛋黃/蛋清全蛋體系而言，冷凍后蛋白質(zhì)變性，雞蛋的蛋黃和蛋白的結(jié)構(gòu)及膠凝性逐漸發(fā)生變化[15]。析水率反映出大分子的持水特性。較低溫度的反復(fù)凍融會導(dǎo)致析水率的下降，這是由于在較低的溫度下，在凍結(jié)的水分子作用力條件下，蛋白所形成的完整高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，蛋液變?yōu)榱髻|(zhì)狀。

3 結(jié)論

本文研究了冷凍儲存凍融處理對雞蛋中氟苯尼考檢測含量的影響。通過考察不同有機(jī)相配比和乙腈的增速的影響分析，確定了90%的乙腈有機(jī)相為最適濃度比例。研究表明，有機(jī)相的增速對氟苯尼考峰形和響應(yīng)值的影響并不明顯，都能出現(xiàn)比較合適的氟苯尼考單峰。-18℃低溫處理會導(dǎo)致氟苯尼考檢測含量的顯著下降，且隨溫度的降低影響越明顯。冷凍達(dá)到一定程度時，雞蛋中的蛋白質(zhì)開始變性，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化，界面張力改變，影響蛋白質(zhì)的起泡性，且以-18℃的影響最為顯著。對于蛋液析水率的變化，凍結(jié)溫度以上的處理不能影響持水特性的改變，低溫導(dǎo)致穩(wěn)定性變差，持水率降低。凍融溫度能顯著影響全蛋液的理化性質(zhì)，凍融周期的處理進(jìn)一步影響了全蛋液凝膠的凍融穩(wěn)定性。