張 琛 陳思博 吳晨源 張步遙 張 瑛 滕 斌,* 胡本進(jìn)

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，安徽 合肥 230031；3 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽 合肥 230031)

粘蟲(chóng)是一種嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食生產(chǎn)安全的重大生物災(zāi)害，是我國(guó)玉米、小麥和水稻常見(jiàn)害蟲(chóng)之一，具有危害范圍廣、發(fā)生時(shí)間長(zhǎng)、受害作物種類(lèi)多等特點(diǎn)[1-2]。自上世紀(jì)90年代，我國(guó)局部地區(qū)粘蟲(chóng)危害一直持續(xù)，直至2012年發(fā)生了全國(guó)性粘蟲(chóng)災(zāi)害大爆發(fā)[3]。目前，利用毒死蜱、吡蟲(chóng)啉、溴氰菊酯等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治是最常用的粘蟲(chóng)治理方式，然而大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)造成環(huán)境污染，增強(qiáng)害蟲(chóng)的抗藥性，還會(huì)產(chǎn)生殺傷天敵等有益生物的負(fù)面效果[4-5]。球孢白僵菌(Beauveriabassiana)屬于昆蟲(chóng)病原真菌，對(duì)環(huán)境友好，已被廣泛應(yīng)用于防治森林害蟲(chóng)和農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)[6]。目前在松毛蟲(chóng)(Dendrolimusspp.)、玉米螟(Ostriniapalustralis)和茶小綠葉蟬(Empoascaflavescens)等害蟲(chóng)防治方面均取得了成功[7]，并且研究工作已從表觀(guān)病理學(xué)、流行病學(xué)層次，逐步深入到真菌與害蟲(chóng)互作的細(xì)胞和分子水平，表明球孢白僵菌作為安全環(huán)保的新型綠色生物農(nóng)藥，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛯?shí)際應(yīng)用價(jià)值[8-9]。然而作為殺蟲(chóng)真菌，球孢白僵菌在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中仍存在菌株防治效果不穩(wěn)定，殺蟲(chóng)活性緩慢，以及自身抗逆性較差等缺點(diǎn)，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中選擇高效菌株進(jìn)行生物防治，是保證真菌農(nóng)藥大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。

昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)過(guò)程中，在遭遇如殺蟲(chóng)劑、微生物侵染、紫外線(xiàn)、重金屬、熱脅迫等自然界各種不良因素時(shí)，蟲(chóng)體會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng)，體內(nèi)保護(hù)性的抗氧化酶和解毒酶的活性會(huì)發(fā)生顯著變化[10]。這些保護(hù)性的抗氧化酶主要包括應(yīng)對(duì)活性氧損傷的過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)以及參與昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)的酚氧化酶(phenoloxidase, PO)，解毒酶則主要包括分解有害物的羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GSTs)[11-12]。與大多數(shù)昆蟲(chóng)病原真菌一樣，球孢白僵菌菌絲入侵寄主后，也會(huì)引起寄主細(xì)胞產(chǎn)生一系列的生理應(yīng)激反應(yīng)，包括細(xì)胞代謝酶活性的變化。然而目前有關(guān)利用球孢白僵菌作為生防菌防治粘蟲(chóng)及其作用機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)評(píng)價(jià)不同球孢白僵菌菌株的生物學(xué)性狀以及對(duì)粘蟲(chóng)的致死率，篩選高效生防菌株，并研究粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)受球孢白僵菌感染后體內(nèi)抗氧化酶和解毒酶的活力變化，以期揭示酶活力變化在粘蟲(chóng)防御反應(yīng)中的作用，為合理利用球孢白僵菌防治粘蟲(chóng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

8株球孢白僵菌菌株和粘蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所提供。

1.2 不同菌株的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及致死率測(cè)定

參照張龍娃等[13]的方法，在培養(yǎng)6 d的球孢白僵菌菌落邊緣，采用直徑為0.5 cm的打孔器，取菌絲塊接種于薩氏培養(yǎng)基 (sabouraud medium， SDAY)，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)處理3組，培養(yǎng)12 d，十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，并計(jì)算菌落生長(zhǎng)速率(mm·d-1)。 采用直徑為0.5 cm的打孔器獲取培養(yǎng)12 d的菌絲塊，加入到含有0.05%吐溫-80的無(wú)菌水中，充分振蕩使孢子分散均勻，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子數(shù)量。用無(wú)菌水收集白僵菌孢子，制成1×107個(gè)·mL-1孢子懸浮液，25℃振蕩培養(yǎng)24 h后，顯微觀(guān)察孢子萌發(fā)數(shù)并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。每菌株3次重復(fù)。

選擇生物學(xué)性狀表現(xiàn)良好的菌株，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采集孢子粉，溶于含有0.05%吐溫-80的滅菌蒸餾水中，制備濃度為1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。在供試粘蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)上方噴撒菌株孢子懸浮液，噴撒量為1 mL，對(duì)照組(CK)則用含0.05%的吐溫-80無(wú)菌水處理。處理后立即將單頭粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)放入指形管中飼養(yǎng)，粘蟲(chóng)飼料配方：麥胚粉20.00 g、玉米葉粉20.00 g、白砂糖2.50 g、瓊脂6.25 g、酵母粉6.25 g、Vc 1.00 g和水100 mL。每菌株處理12頭幼蟲(chóng)，重復(fù)3次。上述試驗(yàn)連續(xù)觀(guān)察10 d，統(tǒng)計(jì)各處理組的死亡幼蟲(chóng)數(shù)。以Abbott公式計(jì)算校正死亡率，校正死亡率=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)×100%。

1.3 粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)保護(hù)酶及解毒酶的測(cè)定

球孢白僵菌孢子懸浮液的制備及幼蟲(chóng)感染處理同1.2方法，共設(shè)24、36、48、60和72 h的感染時(shí)長(zhǎng)處理。菌株感染處理后的3齡幼蟲(chóng)樣品，分別加入0.05 mol·L-1pH值7.0的磷酸緩沖鹽溶液 (phosphate buffer saline， PBS)，經(jīng)研磨后，勻漿液于4℃ 10 000 r·min-1離心15 min，取上清液用于酶活測(cè)定。CAT、POD、PO和GSTs活性采用南京建成生物研制的試劑盒測(cè)定。CarE活性測(cè)定參照金劍雪等[14]的方法，反應(yīng)液含0.5 mL酶液，分別加入0.2 mL 0.04 mol·L-1的PBS(pH值7.0)、0.83 mL 0.03 mmol·L-1的α-乙酸萘酯(含0.000 1 mol·L-1毒扁豆堿液0.03 mL)，在37℃水浴中震蕩30 min，加入0.5 mL顯色劑。室溫下放置30 min于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。重復(fù)3次，根據(jù)α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程求出酶促生成的萘酚量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Origin 17.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率

由表1可知，菌株Bb345、Bb314、Bb378、Bb371生長(zhǎng)速率較快，優(yōu)于其他菌株，其中菌株Bb345的生長(zhǎng)速率最大，達(dá)到2.70 mm·d-1，菌株Bb378、Bb371和Bb314的生長(zhǎng)速率分別為2.58、 2.56和2.53 mm·d-1。 產(chǎn)孢量最多的菌株是Bb378，孢子量為20.44×107個(gè)·mL-1，菌株Bb314的產(chǎn)孢量次之，達(dá)18.32×107個(gè)·mL-1。菌株Bb314、Bb345、Bb378和Bb371的孢子萌發(fā)率高于其他菌株，其中菌株Bb314的萌發(fā)率最高，達(dá)96.12%。

2.2 不同菌株對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)的致死率

根據(jù)生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率數(shù)據(jù)結(jié)果，選用菌株Bb314、Bb378、Bb371和Bb345進(jìn)行感染幼蟲(chóng)致死率試驗(yàn)。從校正死亡率結(jié)果可知，菌株Bb314對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)表現(xiàn)出最強(qiáng)的致病力，致死率高達(dá)69.18%(圖1)。因此，選用菌株Bb314做進(jìn)一步侵染粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)試驗(yàn)，研究該菌株侵染對(duì)蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)性酶和解毒酶活性的影響。

表1 供試球孢白僵菌菌株的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率Table 1 Growth rates, sporulation quantity, and spore germination rates of tested B. bassiana strains

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant differene at 0.05 level.圖1 不同球孢白僵菌菌株對(duì)粘蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)的致死率Fig.1 Lethality rates of the 3rdlarvae of armyworm infected with different strains of B. bassiana

注：不同大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間下，對(duì)照與處理組間酶活性差異顯著(P<0.01)。不同小寫(xiě)字母表示不同時(shí)間處理間酶活性差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different capital letters indicates significant difference between the control and treatment group at the same time (P<0.01). Different lowercase letters indicates significant differences between different treatments of infection time (P<0.05). The same as following.圖2 球孢白僵菌Bb314對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)CAT(A)，POD(B)和PO (C)活性的影響Fig.2 Changes in enzyme activities of CAT(A), POD(B) and PO(C) in armyworm larvae infected with the B. bassiana strain Bb314

2.3 球孢白僵菌Bb314侵染對(duì)粘蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

菌株Bb314侵染粘蟲(chóng)后，蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性的變化如圖2-A所示。結(jié)果表明，處理組CAT活性在侵染24 h時(shí)低于CK，在侵染36～48 h時(shí)迅速升高，CAT活性峰值出現(xiàn)在侵染48 h，為同時(shí)間點(diǎn)CK的1.3倍，然后緩慢下降，至72 h低于CK。由圖2-B可知，3齡幼蟲(chóng)受菌株Bb314侵染24 h后，蟲(chóng)體內(nèi)POD活性開(kāi)始迅速上升，于36 h達(dá)到最大值，為CK的1.63倍，之后POD活性仍保持較高直至60 h；CK的POD活性變化不明顯。CAT和POD是生物體內(nèi)防止活性氧損傷的重要保護(hù)酶，在白僵菌侵染蟲(chóng)體后，POD率先響應(yīng)，迅速升高，而CAT隨后發(fā)生作用。本研究中CAT和POD的活性在侵染后期(72 h)下降，可能是由于白僵菌菌絲大量繁殖產(chǎn)生了較多真菌毒素，引起粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)生理功能失衡，導(dǎo)致CAT和POD的合成及活性受到影響。

PO是昆蟲(chóng)參與免疫反應(yīng)和傷口愈合反應(yīng)的關(guān)鍵酶。由圖2-C可知，菌株Bb314侵染幼蟲(chóng)后，蟲(chóng)體內(nèi)PO活性迅速提高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。侵染后24 h，處理組幼蟲(chóng)體內(nèi)PO活性與CK活無(wú)顯著差異；侵染36 h時(shí)，蟲(chóng)體內(nèi)PO活性最高，且顯著高于CK；侵染72 h后，處理組PO活性，顯著低于CK。以上結(jié)果表明，病原菌的入侵，會(huì)激活PO產(chǎn)生黑化反應(yīng)并消滅入侵的病原菌，但隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，白僵菌在幼蟲(chóng)血腔中的大量繁殖，造成細(xì)胞代謝失衡，導(dǎo)致PO活性下降。

2.4 球孢白僵菌Bb314侵染對(duì)幼蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性的影響

菌株Bb314侵染粘蟲(chóng)后，蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性的變化如圖3-A所示。結(jié)果表明，菌株Bb314侵染24 h后CarE活性變化不明顯，而隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，CarE活性逐漸升高，于侵染48 h達(dá)到峰值，之后開(kāi)始降低；其中侵染36～60 h時(shí)，侵染處理的幼蟲(chóng)體內(nèi)CarE活性顯著高于CK。由圖3-B可知，菌株Bb314侵染24～36 h期間，幼蟲(chóng)體內(nèi)GSTs活性迅速提升，于侵染36 h達(dá)到最大值，且顯著高于CK；侵染48 h后，處理組幼蟲(chóng)體內(nèi)的GSTs活性較CK開(kāi)始下降，且在侵染72 h時(shí)顯著低于CK。

圖3 球孢白僵菌Bb314對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)羧酸酯酶(A)和谷胱甘肽-5-轉(zhuǎn)移酶(B)活性的影響Fig.3 Changes in enzyme activities of CarE (A) and GSTs(B) in armyworm larvae infected with the Beauveria bassiana strain Bb314

3 討論

球孢白僵菌侵染多達(dá)700種以上的昆蟲(chóng)和螨類(lèi)，是使用范圍最廣泛的一種昆蟲(chóng)病原真菌[15]。球孢白僵菌雖已在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)林害蟲(chóng)[16]，然而其在粘蟲(chóng)的生物防治方面還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。昆蟲(chóng)與昆蟲(chóng)病原真菌互作的研究，主要集中在高致病性菌株篩選、真菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝改進(jìn)、真菌毒素直接利用和蟲(chóng)生真菌分子致病機(jī)制等方面[17]，其中高致病力菌株篩選是防治害蟲(chóng)的基礎(chǔ)。研究表明，菌落生長(zhǎng)速率、菌株產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率等生物學(xué)性狀可以作為評(píng)價(jià)菌株致病力的重要指標(biāo)[13-14,18]。孟祥坤等[19]發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對(duì)甜菜夜蛾3齡幼蟲(chóng)具有較高毒力，其產(chǎn)孢量高，生長(zhǎng)最快。代曉彥等[20]通過(guò)研究球孢白僵菌的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量以及對(duì)柑橘木虱若蟲(chóng)的侵染致死率，發(fā)現(xiàn)不同菌株在產(chǎn)孢量方面存在較大差異，而不同菌株的生長(zhǎng)速率及對(duì)木虱低齡若蟲(chóng)的致死率則差異不顯著。周今一等[21]測(cè)試了不同地理來(lái)源的球孢白僵菌對(duì)甜菜夜蛾幼蟲(chóng)的致死效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)同一昆蟲(chóng)病原真菌不同菌株的毒力存在明顯差異。上述研究說(shuō)明，菌株的菌落生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量等在菌株篩選時(shí)不能作為唯一的評(píng)價(jià)指標(biāo)，并且不同地理來(lái)源的菌株對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的致病性也存在一定差異。因此，要篩選到高致病力的球孢白僵菌，需要以具體的昆蟲(chóng)為研究對(duì)象，根據(jù)菌株的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及致死率等生物學(xué)性狀指標(biāo)對(duì)菌株優(yōu)劣進(jìn)行綜合評(píng)判。本研究以8株白僵菌菌株為研究材料，首先比較了這些菌株在生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率等指標(biāo)方面的差異，結(jié)果顯示，4株白僵菌為優(yōu)勢(shì)菌株；進(jìn)一步通過(guò)測(cè)定粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率，對(duì)不同球孢白僵菌菌株的害蟲(chóng)致死率進(jìn)行區(qū)分，最終篩選出的菌株Bb314具有顯著的粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死效果，校正致死率達(dá)到69.18%，且具有良好的生物學(xué)性狀，其中孢子萌發(fā)率高達(dá)96.12%。

球孢白僵菌在侵染寄主時(shí)，其致病力和毒力與所在寄主體內(nèi)的生理狀態(tài)及其環(huán)境存在密切關(guān)系[22-23]。已有研究表明，白僵菌菌絲主要經(jīng)表皮穿透體壁進(jìn)入寄主血腔，與寄主免疫系統(tǒng)發(fā)生抗?fàn)?。PO是昆蟲(chóng)體內(nèi)體液免疫的關(guān)鍵因子，在昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[12]。白僵菌入侵寄主后，寄主體內(nèi)PO被激活可形成黑化反應(yīng)，同時(shí)也造成寄主體內(nèi)活性氧急劇升高[24]。通常，蟲(chóng)體在感染初期，體內(nèi)抗氧化酶如POD、PO、CAT等會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng)[25-26]，但隨著菌絲的大量繁殖，蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶的合成和活性會(huì)受到抑制，表現(xiàn)出體內(nèi)保護(hù)酶活性迅速下降，寄主體內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)被打破，最終引起寄主的一系列生理病理變化，導(dǎo)致寄主感病死亡[27-29]。

昆蟲(chóng)體內(nèi)CarE和GSTs是2種重要的解毒酶，在細(xì)胞內(nèi)許多重要代謝過(guò)程中起著重要作用[30-31]。GSTs廣泛存在于動(dòng)植物中[32]，是細(xì)胞內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的活性蛋白質(zhì)，可以將谷胱甘肽和細(xì)胞內(nèi)各種有害物結(jié)合，并轉(zhuǎn)移出體外，從而降低細(xì)胞毒性，在消除機(jī)體過(guò)氧化物的累積方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用[33]。CarE是專(zhuān)一性催化酯鍵水解酶，不僅參與正常脂類(lèi)代謝，而且可作為解毒酶，對(duì)外源毒素進(jìn)行降解代謝[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌Bb314侵染3齡粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)后，蟲(chóng)體內(nèi)PO、POD和CAT活性均呈先升高再下降的變化趨勢(shì)，GSTs和CarE也呈現(xiàn)出近似的變化規(guī)律(圖2、3)。其中，PO、POD和GSTs是率先發(fā)生作用的酶系,CAT和CarE是隨后發(fā)生作用的酶系，表明粘蟲(chóng)體內(nèi)不同類(lèi)型保護(hù)性酶對(duì)白僵菌浸染的免疫響應(yīng)存在時(shí)效差異。綜合本研究結(jié)果認(rèn)為，球孢白僵菌Bb314感染幼蟲(chóng)初期，幼蟲(chóng)可通過(guò)增強(qiáng)保護(hù)性酶和解毒酶的活性來(lái)維持蟲(chóng)體的正常生理功能。然而，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，球孢白僵菌在幼蟲(chóng)體內(nèi)大量增殖，幼蟲(chóng)自身的防衛(wèi)能力迅速瓦解，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶和解毒酶等活性下降，機(jī)體內(nèi)活性氧自由基和有毒代謝物不能及時(shí)清除，機(jī)能受到嚴(yán)重破壞，引起幼蟲(chóng)體內(nèi)代謝紊亂，無(wú)法進(jìn)行正常的生理生化活動(dòng)，最終導(dǎo)致粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)病、死亡。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)研究球孢白僵菌菌株在產(chǎn)孢量、萌發(fā)率及生長(zhǎng)速率上的差異，并結(jié)合致死率，篩選獲得了生物學(xué)性狀良好且對(duì)粘蟲(chóng)具有高毒力的球孢白僵菌菌株Bb314。球孢白僵菌侵染粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)后，侵染初期由于應(yīng)激響應(yīng)蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶CAT、GSTs和PO和解毒酶GSTs和CarE活性有所上升；后期蟲(chóng)體內(nèi)CAT、GSTs和PO活性下降，其中GSTs和PO活性顯著低于CK，同時(shí)POD和CarE活性也表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明菌株Bb314可能通過(guò)影響幼蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶和解毒酶活性的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而對(duì)粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)生理代謝造成影響。供試菌株中，菌株Bb314對(duì)粘蟲(chóng)的毒力最高，其具有作為粘蟲(chóng)生防菌的應(yīng)用潛力。