李浩,杜江,陳安健,杜洋,梁天才,付梓峰,謝智慧,梁國標
遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,貴州遵義563000
缺血再灌注損傷(IRI)被認為是影響腎移植效果的重要因素。IRI的發(fā)生受許多因素影響,如Ca2+超載、炎癥細胞浸潤、免疫系統(tǒng)激活、基因轉(zhuǎn)錄重新編程、血管內(nèi)皮損傷等[1]。缺血的腎臟經(jīng)再灌注后會進一步加重缺氧和炎癥程度[2]。Degterev等[3]研究發(fā)現(xiàn),一種具有壞死形態(tài)學特征并受多種因子作用影響的細胞主動死亡過程,能按照固定的信號轉(zhuǎn)導通路和執(zhí)行程序發(fā)生,并將這種現(xiàn)象稱為壞死性凋亡。受體相互作用蛋白激酶(RIP)1和RIP-3是壞死性凋亡主要通路的關鍵信號分子,可啟動和調(diào)控壞死性凋亡的發(fā)生發(fā)展[4]。研究顯示,壞死性凋亡在IRI中可發(fā)揮比凋亡更為重要的作用,這為防治腎臟IRI提供了新的探索方向[5,6]。高壓氧(HBO)治療方法是將患者置身于高于標準大氣壓的環(huán)境里呼吸100%的氧氣,其主要用于治療減壓綜合征、急性CO中毒、氣性壞疽、糖尿病足等疾病[7]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn),移植腎缺血再灌注后,HBO治療可通過減輕組織炎癥反應,降低腎IRI對腎功能的損害;還可能通過增強自噬作用,減輕腎IRI,發(fā)揮腎臟保護作用[8]。但HBO對移植腎組織壞死性凋亡影響的相關研究較少。2016年9月~2018年3月,本研究擬通過腎移植技術(shù),建立大鼠腎IRI模型,觀察HBO治療對腎組織RIP-1、RIP-3表達的影響。現(xiàn)報告如下。
1.1 實驗動物與主要實驗材料 健康6~8周齡SPF級雄性SD大鼠90只,體質(zhì)量180~220 g,購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。大鼠于溫度16~26 ℃、相對濕度45%~70%環(huán)境中分籠飼養(yǎng)2周。RIP-1蛋白抗體購于美國Proteintech Group公司,RIP-3蛋白抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司,抗體稀釋液、山羊血清、多聚體抗兔IgG-HRP、蘇木素染液、PBS緩沖液、枸櫞酸緩沖液購于武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 腎移植IRI模型制作及分組處理 90只大鼠隨機分為腎移植組、HBO治療組各36只,假手術(shù)組18只。腎移植組、HBO治療組參考Bao等[8]方法建立左腎移植IRI模型。建模成功標準:供體大鼠左側(cè)腎臟在體灌注后,腎臟顏色蒼白,恢復血液再灌注后移植腎動脈恢復搏動,蒼白的腎臟逐漸變紅潤,觀察5~10 min見輸尿管有尿液流出。假手術(shù)組不進行腎移植操作,行右腎切除術(shù)后關閉腹腔。HBO治療組分別于腎移植術(shù)后0、2、4 h置于動物實驗高壓氧艙內(nèi),純氧洗艙5 min后加壓至0.02 MPa,5 min后再加壓至0.1 MPa,穩(wěn)壓吸氧40 min后減壓10 min,共計1 h,保持艙內(nèi)氧濃度在95%以上。腎移植組及HBO治療組大鼠分別于再灌注后1、3、5 h經(jīng)腹腔注射麻醉后切取移植腎,假手術(shù)組于相應時點切取左腎,并處死大鼠(各時點6只)。取腎臟部分皮髓質(zhì),用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋切片(5 μm厚),以備HE染色和免疫組化檢測。
1.3 腎組織病理觀察 采用HE染色,顯微鏡下觀察各組腎組織病理變化。
1.4 腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白檢測 采用免疫組化法檢測各組腎組織中的RIP-1、RIP-3蛋白。步驟如下:制備5 μm厚石蠟切片并脫蠟至水;PBS沖洗后將切片置入3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶;將切片完全浸泡在盛有EDTA抗原修復液的修復盒中,微波抗原修復,室溫下自然冷卻后滴加正常山羊血清封閉液;滴加一抗(RIP-1 1∶100、RIP-3 1∶100),陰性對照滴加PBS代替一抗,置入濕盒中4 ℃冰箱過夜;溫箱復溫后滴加多聚體抗兔IgG-HRP(二抗),37 ℃溫箱孵育;鏡下DAB顯色后蘇木素染色;1%鹽酸乙醇中分化3 s并沖洗10 min;脫水,透明,封片,鏡下觀察結(jié)果。以腎臟組織中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為RIP-1、RIP-3陽性表達。顯微鏡高倍視野下(400×)每張切片隨機采集5個視野,Leica Qwin圖像處理系統(tǒng)采集圖像,用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量積分光密度(IOD)值,作為目的蛋白相對表達量。
2.1 各組腎組織病理變化 假手術(shù)組各時間點腎組織結(jié)構(gòu)基本正常。腎移植組腎小管管腔擴張,腎小球體積增大,上皮細胞明顯腫脹,部分組織呈現(xiàn)顆粒樣變性,并出現(xiàn)蛋白樣管型及中性粒細胞浸潤,隨著時間延長而損傷加重。HBO治療組有不同程度腎小管管腔擴張、腎小球體積增大及上皮細胞腫脹變形,有少量中性粒細胞浸潤和顆粒樣變性,組織損傷較腎移植組減輕。見圖1。
圖1 各組大鼠腎組織病理變化(HE染色,400×)
2.2 各組腎組織RIP-1、RIP-3蛋白表達比較 HBO治療組、腎移植組再灌注后1、3、5 h腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白表達均逐漸升高,組內(nèi)不同時點相比,P均<0.05。HBO治療組、腎移植組再灌注后1、3、5 h腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白表達均高于假手術(shù)組,且HBO治療組相同時點腎組織中RIP-1、RIP-3蛋白表達低于腎移植組(P均<0.05)。詳見表1、2。
表1 各組腎組織RIP-1蛋白表達比較
表2 各組腎組織RIP-3蛋白表達比較
IRI指在各種原因?qū)е氯毖A上,組織器官恢復血流再灌注后,細胞出現(xiàn)代謝障礙并使其功能和結(jié)構(gòu)破壞,損傷程度反而加重的現(xiàn)象。缺血導致氧供降低,引起嚴重的缺氧與微血管功能障礙。而再灌注后可進一步觸發(fā)激活免疫反應以及程序性細胞死亡等損傷機制,加重組織器官功能損害[9]。對于腎移植患者,腎IRI是影響早期腎功能恢復和患者長期存活的主要因素之一[10]。
壞死性凋亡是細胞死亡形式的特殊類型,是呈現(xiàn)壞死形態(tài)學特征并受多種信號轉(zhuǎn)導因子作用影響的細胞主動死亡過程。研究發(fā)現(xiàn),壞死性凋亡一般發(fā)生于病毒感染和細菌感染,同時也發(fā)生在神經(jīng)退行性疾病、炎癥及器官IRI中[11]。壞死性凋亡是一種由死亡受體及配體啟動,依賴RIP介導活化非Caspase依賴的可調(diào)控程序性壞死。RIP屬于絲氨酸/酪氨酸激酶家族,是參與細胞凋亡、壞死的重要信號轉(zhuǎn)導分子。RIP共有7個家族成員,其中RIP-1、RIP-3在啟動和調(diào)控壞死性凋亡中發(fā)揮關鍵作用。有研究表明,RIP-3是細胞發(fā)生壞死性凋亡所必需的蛋白激酶[12]。
壞死性凋亡的主要通路如下:當Caspase受到抑制時,RIP-1在TNF-α或Fas刺激誘導下被激活,并與RIP-3在磷酸化等作用下形成necrosome信號復合體,進一步激活RIP-3使混合系激酶結(jié)構(gòu)蛋白(MLKL)磷酸化,打開下游通路,MLKL被激活后由單體狀態(tài)轉(zhuǎn)化為寡聚體狀態(tài),從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜,并形成通透性孔道,破壞細胞膜的完整性,最終導致細胞壞死。RIP-1和RIP-3形成necrosome復合體是發(fā)生壞死性凋亡的特異性標志[13]。當細胞在病理狀態(tài)下不能產(chǎn)生足夠的ATP以維系Caspase功能時,依賴Caspase作用的細胞凋亡通路出現(xiàn)障礙,很容易導致細胞發(fā)生不依賴Caspase的壞死性凋亡[14]。因此,壞死性凋亡參與許多疾病的病理過程和器質(zhì)性損傷,尤其是在IRI、急性炎癥、病毒感染中發(fā)揮著重要作用[15]。
HBO的治療機制被認為與升高氧分壓有關,一定劑量的HBO可使機體抗氧化能力加強,可以清除過多氧自由基,從而保護組織細胞免受自由基的氧化損傷,這是HBO治療許多疾病的重要分子基礎[16]。HBO還可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外水、電解質(zhì)平衡,調(diào)節(jié)缺血部位微血管舒縮,改善微循環(huán)血流動力學,減輕局部水腫等作用,提高組織液和血液的氧含量、氧張力并增強能量代謝和有氧氧化,進而改善局部缺氧情況[17]。另外,HBO還可提高Na+-K+-ATP酶活性,降低細胞內(nèi)Ca2+濃度,使細胞膜功能恢復正常,這些作用有利于減輕腎IRI、保護腎功能[18]。既往研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導因子1α(HIF-1α)參與了腎IRI的病理生理過程,HBO可通過上調(diào)HIF-1α mRNA的表達,發(fā)揮保護腎功能的作用[19]。我們還發(fā)現(xiàn),IRI可能通過誘導TNF-α和氧自由基的大量產(chǎn)生,加重腎組織細胞凋亡,進一步加重腎功能損害;而HBO干預可能通過抑制TNF-α和丙二醛的產(chǎn)生,減輕組織脂質(zhì)過氧化,進而減少細胞凋亡,發(fā)揮腎保護效應。
本研究前期工作發(fā)現(xiàn),再灌注后腎功能受到明顯損害,HBO能明顯減輕腎IRI,保護腎功能,其機制主要包括減輕組織炎癥反應和增強自噬作用等[8]。研究還發(fā)現(xiàn),HBO治療可通過抑制ICAM-1和VCAM-1過表達、C3補體活化、ED1浸潤和Th17細胞的聚集發(fā)揮腎保護作用[20]。我們在前期工作的基礎上,初步探討了壞死性凋亡關鍵因子在IRI腎組織中的表達變化以及HBO對其表達的影響。本研究結(jié)果顯示,在腎移植后RIP-1、RIP-3的表達隨再灌注時間延長而顯著增高,HBO治療后其表達水平則顯著降低,并隨時間延長越來越明顯。這表明,再灌注早期即可發(fā)生RIP-1、RIP-3的表達增高,激活壞死性凋亡相關通路,進而加重腎臟損害。HBO治療有助于減少RIP-1、RIP-3的表達,抑制壞死性凋亡的發(fā)生,從而減輕腎IRI,實現(xiàn)保護腎臟的目的。通過HE染色也觀察到,HBO治療后移植腎組織的病理改變也得到明顯改善。
綜上所述,IRI能顯著誘導RIP-1、RIP-3在腎組織中的表達,而HBO治療能明顯抑制二者的表達,這是HBO在腎IRI中發(fā)揮腎保護作用的又一重要機制。但壞死性凋亡在腎IRI發(fā)生中的作用機制以及HBO對壞死性凋亡調(diào)控的機制還需進一步深入研究。