陳素珠，盧文顯，林典梁，杜生榮，林運(yùn)鴻，鄭備紅

1福建省婦幼保健院 福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，福州350001；2福建醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因敲除技術(shù)的應(yīng)用越來越普遍。相應(yīng)基因敲除的小鼠全基因組中都會(huì)出現(xiàn)基因表達(dá)缺失，常會(huì)影響其繁殖，無法對(duì)其發(fā)育后期的基因功能進(jìn)行分析，這時(shí)候需要應(yīng)用到條件性敲除小鼠。目前能實(shí)現(xiàn)條件性敲除的技術(shù)有Cre-loxp系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。Cre-loxp系統(tǒng)應(yīng)用最普遍，由Cre重組酶和loxp位點(diǎn)組成[1～3]。借助基因編輯技術(shù)把兩個(gè)loxp序列加入到目的基因的重要的外顯子兩端，制備出loxp小鼠即為條件性敲除小鼠，該目的基因表達(dá)不受loxp序列影響，當(dāng)該小鼠與組織特異性表達(dá)cre重組酶的小鼠雜交后，cre重組酶可以使兩側(cè)loxp位點(diǎn)發(fā)生重組，目的基因完整性被破壞從而發(fā)生基因沉默。組蛋白去甲基化酶Kdm2b蛋白是組蛋白去甲基化酶家族JMJC蛋白的成員，在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、腫瘤發(fā)生的調(diào)控中起重要作用[4]。Kdm2b敲除可致小鼠出現(xiàn)顱面部發(fā)育不全、腦癱和低外顯率的卷尾[5]。因此，條件性敲除小鼠為研究Kdm2b基因提供了載體。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種新型基因編輯技術(shù)，通過sgRNA介導(dǎo)核酸酶Cas9對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別、切割，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，基因編輯效率高[6]。2018年7月～2019年2月，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和同源重組的原理將loxp序列插入到Kdm2b基因中，為后期制備條件性敲除鼠及基因功能研究進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞、細(xì)菌和質(zhì)粒：NIH3T3細(xì)胞(福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)，pEASY-Blunt Cloning Vector、Trans1-T1(TransGen公司)，PX459、PX458(Addgene公司)，Vector 5(福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)，Top10(TaKaRa公司)，pBlueScript Ⅱ KS Vector(STRATAGENE公司)。試劑：Lipo2000(Invitrogen公司)，嘌呤霉素(Life technologies公司)，胎牛血清、青霉素/鏈霉素(Amresco公司)，氨芐青霉素(上海生工公司)，10×PCR Buffer、10×Loading Buffer(TaKaRa公司)，RNase And DNase Away、質(zhì)粒提取試劑盒(Roche公司)，DMEM(Gibco公司)，Wizard DNA Clean-Up核酸純化試劑盒(Promega公司)，T7E1(NEW ENGLAND Biolabs公司)。Kdm2b基因5臂正向引物序列為GTGCCCTCCTCTTACTCAGGTTTCG，反向引物序列為ATGTGGAAGTCAGTGAAACAGCCCT；Kdm2b基因3臂正向引物序列為GGCTACACCTTTTTCATCCCTTC，反向引物序列為ACCGACTATTACCTCCCTCATTG；Target正向引物序列為TCGAATTCACTCTGCAGTGGTAGGTCGCTCGCC，反向引物序列為TCGAATTCGCAGGAGGCTGCTTTCAAGTGCCGG；Donor DNA的5臂正向引物序列為CTGCAAGCCAAGGTGCTGTCTGTGA，反向引物序列為AGTCTCGAGCACCTGACTCAACAGCCT；Donor DNA的3臂正向引物序列為GCGTCGACAGTTCTGTGGTCTCAGCCAGGGCTG，反向引物序列為TAGAGGAAGACCCAAGGAAGACATT。主要儀器：電泳槽、凝膠電泳儀(北京六一公司)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)，PCR儀(5333型，Eppendorf公司)，生物安全柜(HealForce公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)，相差倒置顯微鏡(CKX-41型，Olympus公司)。

1.2 定點(diǎn)切割雙鏈基因組DNA的sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)前期研究設(shè)計(jì)構(gòu)建的sgRNA表達(dá)載體，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站上搜索小鼠Kdm2b基因序列，利用http://crispr.mit.edu/設(shè)計(jì)靶序列，在Kdm2b基因第7個(gè)外顯子的5臂端篩選靶序列sgRNA5-2并在5臂加入BbsⅠ位點(diǎn)，sgRNA5正向序列為GGGAAACTCCACTTCGATAGAGG，PAM結(jié)構(gòu)為AGG。同法在Kdm2b基因第9個(gè)外顯子的3臂端篩選靶序列sgRNA3-2并在3臂加入BbsⅠ位點(diǎn)，sgRNA3正向序列為GAACCATTGACGTGCCCTGAGGG，PAM結(jié)構(gòu)為AGG。根據(jù)所設(shè)計(jì)的序列合成sgRNA核苷酸鏈，退火后連接到已用BbsⅠ酶切后的線性pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)質(zhì)粒中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transgenic1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷sgRNA是否正確插入到載體中。

1.3 帶有l(wèi)oxp序列的雙鏈Donor DNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 分別根據(jù)前期篩選的sgRNA5和sgRNA3的切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的Donor DNA。Donor5 DNA作為sgRNA5同源重組的外源模板DNA，其3臂端具有EcoRⅠ酶切識(shí)別序列。Donor3 DNA作為sgRNA3同源重組的外源模板DNA，其5臂端具有EcoRⅠ酶切識(shí)別序列。分別用Donor DNA的5臂引物和Donor DNA的3臂引物從NIH3T3細(xì)胞基因組中克隆Kdm2b基因的5臂與3臂sgRNA位點(diǎn)的兩側(cè)同源臂片段。將5臂和3臂的同源臂片段插入帶有l(wèi)oxp序列的Vector 5質(zhì)粒中，提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定。根據(jù)loxp兩側(cè)的同源臂設(shè)計(jì)引物，以此前構(gòu)建的帶有同源臂片段的Vector 5載體作為模板，擴(kuò)增出含有l(wèi)oxp序列(帶EcoRⅠ酶切位點(diǎn))的雙鏈Donor DNA，測(cè)序鑒定。Kdm2b基因的Donor DNA設(shè)計(jì)情況見圖1。

注：Donor5插入位點(diǎn)位于Kdm2b基因第7個(gè)外顯子5臂端，與sgRNA5的切割位點(diǎn)相距50 bp；Donor3插入位點(diǎn)位于Kdm2b基因的第9個(gè)外顯子3臂端，與sgRNA3的切割位點(diǎn)相距60 bp。

1.4 特定切割位點(diǎn)loxp序列敲入

1.4.1 sgRNA5切割位點(diǎn)的loxp序列敲入 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的Donor5和sgRNA5共同轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞中，24 h后進(jìn)行嘌呤霉素篩選8 d，形成陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。挑取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，提取基因組。設(shè)計(jì)鑒定引物(5-鑒定引物-F&T-R)對(duì)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增Kdm2b基因片段，獲得產(chǎn)物，經(jīng)過EcoRⅠ酶切后得到酶切產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)序。

1.4.2 sgRNA3切割位點(diǎn)的loxp序列敲入 將已經(jīng)在sgRNA5切割位點(diǎn)插入loxp序列的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Donor3和sgRNA3共同轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞中，24 h后進(jìn)行嘌呤霉素篩選12 d，形成陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。挑取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，提取基因組。設(shè)計(jì)鑒定引物(3-鑒定引物-F&3-鑒定引物-R)對(duì)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增Kdm2b基因片段,獲得產(chǎn)物，經(jīng)過EcoRⅠ酶切后得到酶切產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并測(cè)序。

2 結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，sgRNA5和sgRNA3的PCR產(chǎn)物片段大小約200 bp，同時(shí)測(cè)序結(jié)果也正確，說明sgRNA5和sgRNA3都正確連接到PX459質(zhì)粒上。Donor3和Donor5 DNA測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)相符合。將Donor5和sgRNA5共同轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞中，選取陽(yáng)性單克隆(圖2)，提取基因引物擴(kuò)增、酶切鑒定，分別得到大小為2 000、200、350 bp的酶切產(chǎn)物，符合設(shè)計(jì)；該克隆基因組測(cè)序報(bào)告顯示，loxp-EcoRⅠ序列正確插入到基因組中。見圖3。將Donor3和sgRNA3共同轉(zhuǎn)染到已插入一個(gè)loxp序列的NIH3T3細(xì)胞中，選取陽(yáng)性單克隆(圖4)，提取基因引物擴(kuò)增、酶切鑒定，分別得到大小為800、100 bp的酶切產(chǎn)物，符合設(shè)計(jì)；該克隆基因組測(cè)序報(bào)告顯示，EcoRⅠ-loxp序列正確插入到基因組中。見圖5。通過兩次轉(zhuǎn)染將loxp序列成功插入到Kdm2b基因第7個(gè)外顯子和第9個(gè)外顯子兩端。

注：a、d為轉(zhuǎn)染Donor5的NIH3T3細(xì)胞；b、e為轉(zhuǎn)染Donor5和PX459的NIH3T3細(xì)胞；c、f為轉(zhuǎn)染Donor5和PX459-sgRNA5的NIH3T3細(xì)胞。

3 討論

KDM2B是JMJC家族的一個(gè)去甲基化酶，能特異性催化組蛋白H3第4位三甲基賴氨酸及組蛋白H3第36位三甲基賴氨酸去甲基化[7]。研究表明，KDM2B的作用包括抑制細(xì)胞衰老、分化、凋亡，維持細(xì)胞干性，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和代謝等[8，9]。關(guān)于KDM2B在惡性腫瘤中作用的研究較多，但其在不同腫瘤中的作用各不相同，甚至可能出現(xiàn)相反的情況。在胰腺癌、胃癌、膀胱癌、鼻咽癌、卵巢癌中，KDM2B高表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞更具侵襲性[10～13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過敲低小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中KDM2B的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[14]。Konuma等[15]報(bào)道，在造血干細(xì)胞中KDM2B能與多梳蛋白形成復(fù)合物，以維持干性。同樣的，頂端乳頭干細(xì)胞中KDM2B過表達(dá)也會(huì)抑制細(xì)胞的分化[16]。Hong等[17]研究發(fā)現(xiàn)，KDM2B能與糖酵解相關(guān)基因Myc啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合，抑制糖酵解并促進(jìn)氧化磷酸化，抑制胃癌細(xì)胞增殖。另外，KDM2B還可通過MoMuLV來影響急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓細(xì)胞白血病的發(fā)生，當(dāng)KDM2B過表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)這兩種白血病的發(fā)病，敲除KDM2B后可抑制細(xì)胞增殖并降低肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。然而，在HeLa細(xì)胞、人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過表達(dá)KDM2B可干擾這兩種腫瘤細(xì)胞的增殖和代謝[18，19]。因此，在不同組織或類型的腫瘤中，KDM2B的生物學(xué)功能各不相同，其作用機(jī)制還不明確，有待進(jìn)一步研究。

注：A為Kdm2b基因的5臂sgRNA的設(shè)計(jì)情況，其中WT為未經(jīng)過基因編輯的Kdm2b基因組，外顯子7上游有1個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，此位點(diǎn)下游為Donor5插入位置，Donor5帶有的loxp序列下游也有1個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；Target為基因組中插入Donor5的Kdm2b基因，經(jīng)酶切后可形成大小為2 000、200、350 bp的片段。B為轉(zhuǎn)染Donor5和sgRNA5的NIH3T3細(xì)胞Kdm2b基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M為DNA Marker，1為陽(yáng)性質(zhì)粒，2為轉(zhuǎn)染Donor5和PX459-sgRNA5的NIH3T3細(xì)胞，3為轉(zhuǎn)染Donor5和PX459的NIH3T3細(xì)胞。C為轉(zhuǎn)染Donor5和sgRNA5的NIH3T3細(xì)胞Kdm2b基因測(cè)序分析結(jié)果。

注：a、d為未經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞；b、e為轉(zhuǎn)染Donor3和PX459-sgRNA3的NIH3T3細(xì)胞；c、f為轉(zhuǎn)染Donor3和PX459-sgRNA3的NIH3T3細(xì)胞。

KDM2B是小鼠發(fā)育過程中重要的基因。利用動(dòng)物模型研究KDM2B基因時(shí)通常需要敲除該基因。但是敲除KDM2B后，小鼠常常出現(xiàn)器官發(fā)育不全、生殖能力下降等問題。此時(shí)，需要通過條件性敲除的方式來避免這樣的問題出現(xiàn)。Cre-loxp系統(tǒng)是最常用的一種條件性基因敲除系統(tǒng)。Cre-loxp系統(tǒng)其由Cre重組酶和loxp位點(diǎn)組成，是一種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[1]。loxp位點(diǎn)是一段由兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8 bp的不對(duì)稱間隔區(qū)組成的DNA序列[2]。Cre重組酶可以特異性識(shí)別loxp位點(diǎn)，并引起兩個(gè)loxp位點(diǎn)間的DNA序列發(fā)生特異性的重組[1～3]。Cre重組酶根據(jù)loxp序列在基因中的位置、方向不同可以敲除、倒轉(zhuǎn)和染色體易位。當(dāng)兩個(gè)loxp序列在同一條DNA鏈且方向相同時(shí)，cre重組酶能敲除兩個(gè)loxp序列直接的DNA片段[20]。通在條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建過程中，必須把兩個(gè)loxp序列準(zhǔn)確插入到需要敲除的基因的兩側(cè)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是利用sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)特定基因位置進(jìn)行基因切割的新型基因編輯技術(shù)。本研究采用同源重組的方式將loxp序列加入到特定位點(diǎn)，但是同源重組的發(fā)生率很低。通過引入CRISPR/Cas9系統(tǒng)，使同源重組位點(diǎn)DNA鏈發(fā)生斷裂，修復(fù)的過程中發(fā)生同源重組的概率就會(huì)顯著提高。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和同源重組的原理，通過兩次轉(zhuǎn)染將loxp序列成功插入到Kdm2b基因第7個(gè)外顯子和第9個(gè)外顯子兩端，成功構(gòu)建Kdm2b基因敲入雙loxp序列的NIH3T3細(xì)胞株，為后期Kdm2b基因條件性敲除小鼠的制備和該基因的功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

注：A為Kdm2b基因的3臂sgRNA的設(shè)計(jì)情況，其中WT為未經(jīng)過基因編輯的Kdm2b基因組，外顯子9下游為Donor3插入位置，Donor3帶有的loxp序列上游也有1個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；Target為基因組中插入Donor3的Kdm2b基因，經(jīng)酶切后可形成大小為100、700 bp的片段。B為轉(zhuǎn)染Donor3和sgRNA3的NIH3T3細(xì)胞Kdm2b基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M為DNA Marker，1為陽(yáng)性質(zhì)粒，2為轉(zhuǎn)染Donor3和PX459-sgRNA3的NIH3T3細(xì)胞，3為轉(zhuǎn)染Donor3和PX459的NIH3T3細(xì)胞。C為轉(zhuǎn)染Donor3和sgRNA3的NIH3T3細(xì)胞Kdm2b基因測(cè)序分析結(jié)果。