陳露露，祁佐良

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院，北京100144

難治性創(chuàng)面修復(fù)是修復(fù)重建外科領(lǐng)域的一大難題。由糖尿病引起的周圍神經(jīng)及其相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)血管的結(jié)構(gòu)和功能障礙是導(dǎo)致難治性創(chuàng)面的非常重要的原因。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，丙酮醛(MGO)和糖基化終產(chǎn)物(AGE)的堆積在周圍神經(jīng)病變及血管病變中起到了至關(guān)重要的作用[1]?；⒄溶?PD)是從植物虎杖中提取的單體，具有多種生物學(xué)活性和廣泛的藥理學(xué)作用[2～6]。近年來(lái)，PD對(duì)糖尿病相關(guān)心血管及腎臟疾病的治療作用已被廣泛研究[7～9]，但其對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的影響尚不明確。為初步探討PD對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的影響，2016年4月～2018年4月，我們以周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞——施萬(wàn)細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用MGO體外損傷施萬(wàn)細(xì)胞以模擬體內(nèi)糖尿病周圍神經(jīng)病變模型[10]，觀察PD預(yù)處理后施萬(wàn)細(xì)胞的活性變化及凋亡情況，探討PD對(duì)施萬(wàn)細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床上難治性創(chuàng)面和周圍神經(jīng)病變的修復(fù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要材料 大鼠施萬(wàn)細(xì)胞系RSC96取自中國(guó)科學(xué)院。高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自加拿大Gibco公司。二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.4% MGO工作液、PD、4%多聚甲醛溶液(PFA)、1% TritonX-100、熒光封片劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天公司。兔多克隆一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。羊抗兔IgG熒光二抗、TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。TUNEL染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。熒光定量RT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成。GAPDH上游引物序列為5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA-3′，下游引物序列為5′-TGGTAACCAGGCGTCCGATA-3′；Caspase-3基因上游引物序列為5′-GCTGGACTGCGGTATTGAGA-3′，下游引物序列為5′-CCATGACCCGTCCCTTGA-3′。

1.2 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 施萬(wàn)細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至90%融合時(shí)采用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，并以(1～2)×105/mL重新接種培養(yǎng)以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞采用4% PFA固定和10%羊血清封閉后，加入GFAP抗體、MBP抗體(0.5% BSA稀釋)和羊抗兔二抗行免疫熒光染色以鑒定細(xì)胞特性。將施萬(wàn)細(xì)胞分為空白對(duì)照組、MGO組、PD組。空白對(duì)照組細(xì)胞體外培養(yǎng)48 h后改用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加入任何藥物處理。MGO組細(xì)胞體外培養(yǎng)48 h后改用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，隨后加入1.65 mmol/L的MGO分別培養(yǎng)6、24 h。PD組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后改用無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)分別加入50、100、200、300 μmol/L的PD培養(yǎng)12 h，隨后加入1.65 mmol/L的MGO分別培養(yǎng)6、24 h。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 吸除96孔板中各組細(xì)胞的上清液，PBS清洗后，每孔加入100 μL的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液和10 μL的CCK-8試劑。將96孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，隨后吸取上清液于新96孔板中。最后采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%。對(duì)照組細(xì)胞活性設(shè)為100%。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL染色試劑盒進(jìn)行染色。細(xì)胞樣本采用4% PFA固定30 min后用PBS清洗，加入1% TritonX-100室溫放置3～5 min后用PBS清洗。細(xì)胞中加入100 μL配好的反應(yīng)液，37 ℃孵育30 min，隨后PBS清洗。吸干水分后，加入50 μL的TdT酶反應(yīng)液，37 ℃避光孵育60 min，隨后PBS清洗。吸干水分后，加入50 μL的TdT酶反應(yīng)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗。加入50 μL的Streptavidin-TRITC標(biāo)記液，37 ℃避光孵育30 min，隨后PBS清洗。最后DAPI染細(xì)胞核10 min，PBS清洗，封片劑封片。于熒光顯微鏡下(100×)隨機(jī)拍攝6個(gè)視野照片，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率即為細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞中Caspase-3 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。將各組待檢測(cè)細(xì)胞移去培養(yǎng)液后PBS清洗。加入1 mL的TRIzol反復(fù)吹打，加入氯仿400 μL，震蕩30 s，4 ℃靜置15 min后以12 000 r/min、4 ℃離心15 min。取上層無(wú)色液體，加入相同量的異丙醇，顛倒混勻靜置10 min后以12 000 r/min、離心半徑8 cm、4 ℃離心10 min。舍棄上清，加入75%乙醇以7 500 r/min、4 ℃離心5 min。用40 μL的DEPC水溶解RNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度。按每管2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系12 μL包括4 μL的Buffer、1 μL的酶抑制劑、1 μL的Oligo、1 μL的逆轉(zhuǎn)錄酶、1 μL的dNTP、RNA及水。反應(yīng)條件為30 ℃、10 min，42 ℃、60 min。最后所得樣本以4 ℃保存。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量[11]。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性比較 損傷處理后6、24 h，MGO組細(xì)胞活性低于空白對(duì)照組，PD組細(xì)胞活性高于MGO組(P均<0.05)；PD組中，100 μmol/L PD處理的細(xì)胞活性高于50 μmol/L，而200、300 μmol/L PD處理的細(xì)胞活性低于100 μmol/L(P均<0.05)，提示PD濃度為100 μmol/L時(shí)對(duì)施萬(wàn)細(xì)胞RSC96具有最佳的保護(hù)作用，而200、300 μmol/L濃度可能對(duì)細(xì)胞已經(jīng)具有損傷作用。因此在后續(xù)凋亡實(shí)驗(yàn)中，PD組選擇100 μmol/L亞組的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。具體結(jié)果見表1。

表1 不同損傷處理時(shí)間各組細(xì)胞活性比較

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 損傷處理后24 h各組細(xì)胞凋亡率均高于損傷后6 h(P均<0.05)；損傷處理后6、24 h，MGO組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組，PD組細(xì)胞凋亡率低于MGO組(P均<0.01)。見表2。

表2 不同損傷處理時(shí)間各組細(xì)胞凋亡率比較

2.3 各組細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)比較 損傷處理后6、24 h，MGO組細(xì)胞Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組，PD組細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)低于MGO組(P均<0.05)。見表3。

表3 不同損傷處理時(shí)間各組細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)比較

3 討論

周圍神經(jīng)系統(tǒng)是由膠質(zhì)細(xì)胞(即施萬(wàn)細(xì)胞)和神經(jīng)元細(xì)胞組成，其功能異常的原因多見于外傷或自身疾病。在自身疾病中，由糖尿病引起的末梢周圍神經(jīng)病變?cè)谂R床中最常見。糖尿病神經(jīng)病變是指體內(nèi)長(zhǎng)期的高血糖引起神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)各種病理生理異常從而產(chǎn)生的神經(jīng)系統(tǒng)損害，其中末梢周圍神經(jīng)系統(tǒng)最常受累。糖尿病周圍神經(jīng)病變是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，可能包含多種途徑的激活，如MGO和AGE的大量堆積、氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白激酶C通路的活化、多元醇通路的激活等[12]。由于其產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前很難在體外完全模擬出體內(nèi)的神經(jīng)病變。

高糖引起的MGO、AGE的形成和大量堆積是糖尿病周圍神經(jīng)病變發(fā)生的主要機(jī)制之一[1,13]。MGO是AGE的二羰基前體，在正常機(jī)體內(nèi)其水平很低。糖尿病患者體內(nèi)MGO的含量異常增高，大量聚集的MGO可引起組織細(xì)胞損傷，還可通過(guò)生成AGE對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯的毒性作用[14]。鑒于以上原因，目前許多研究采用MGO體外損傷刺激細(xì)胞來(lái)間接模擬糖尿病病損[9,10]。施萬(wàn)細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生糖尿病周圍神經(jīng)病變時(shí)，施萬(wàn)細(xì)胞出現(xiàn)反應(yīng)性、增生性和退行性改變，發(fā)生凋亡、壞死，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)軸突出現(xiàn)病理?yè)p害，最終使周圍神經(jīng)發(fā)生不可逆損傷[15]。因此，保護(hù)施萬(wàn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能是防治糖尿病周圍神經(jīng)病變中不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

PD是白藜蘆醇與葡萄糖結(jié)合的產(chǎn)物，屬于一種芪類化合物，具有多種藥理學(xué)作用。其分子中含有3個(gè)酚羥基，為一種氧自由基清除劑，可通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生和保護(hù)線粒體功能來(lái)發(fā)揮強(qiáng)效抗氧化和抗炎作用[16,17]。與白藜蘆醇相比，PD的抗氧化、清除氧自由基的能力更強(qiáng)[18]。PD的抗衰老及對(duì)中樞神經(jīng)、心肌、肝臟、肺臟等的保護(hù)作用已被大量報(bào)道[16]。本研究以施萬(wàn)細(xì)胞為研究對(duì)象，以MGO誘導(dǎo)損傷，并觀察PD的干預(yù)作用。本研究結(jié)果顯示，PD預(yù)處理能有效地減弱MGO對(duì)施萬(wàn)細(xì)胞RSC96的損害，維持細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，且在細(xì)胞損傷早期(6 h)和晚期(24 h)均表現(xiàn)出穩(wěn)定的保護(hù)作用。這提示PD對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變具有一定的防治作用。值得一提的是，PD組中的200、300 μmol/L PD處理的細(xì)胞活性明顯低于100 μmol/L，說(shuō)明200 μmol/L的PD已經(jīng)呈現(xiàn)毒性作用，PD只有在一定濃度范圍內(nèi)才能更好地發(fā)揮保護(hù)功能。

目前認(rèn)為，經(jīng)典的凋亡途徑分為三條，即線粒體途徑、死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[19]。三條途徑中除了線粒體途徑中的AIF途徑(通過(guò)線粒體釋放直接誘導(dǎo)凋亡)，其他途徑都可經(jīng)過(guò)Caspase家族的激活實(shí)現(xiàn)凋亡。在Caspase家族中，Caspase-3是最重要的效應(yīng)性蛋白裂解酶，是細(xì)胞凋亡信號(hào)下游的關(guān)鍵執(zhí)行者。本研究結(jié)果顯示，施萬(wàn)細(xì)胞經(jīng)MGO處理后，細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯增高，說(shuō)明MGO具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用；而PD預(yù)處理可有效減少細(xì)胞凋亡率和Caspase-3 mRNA表達(dá)，證實(shí)PD可通過(guò)抑制施萬(wàn)細(xì)胞的凋亡達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，PD預(yù)處理可減輕MGO誘導(dǎo)的施萬(wàn)細(xì)胞損傷，維持細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用PD防治周圍神經(jīng)病變提供了理論參考。