王雪芳，胡勇

(上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 上海市兒童醫(yī)院 新生兒科，上海 200062)

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)作為新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU)最常見(jiàn)的胃腸道急癥，是導(dǎo)致早產(chǎn)兒和低出生體重兒(LBW)死亡的重要原因之一。近年來(lái)，隨著極低出生體重兒(VLBW)、LBW病死率的下降，NEC的發(fā)病率逐漸升高。在中國(guó)，VLBW和LBW的NEC發(fā)生率分別為4.5%和2.5%，Ⅱ、Ⅲ期NEC死亡率為41.7%[1]。NEC發(fā)病急、進(jìn)展快，早診斷、早治療對(duì)提高NEC患兒生存率和遠(yuǎn)期治愈率有著極為重要的意義。依據(jù)NEC的病因?qū)W和臨床癥狀，目前正在開(kāi)展的早期臨床診斷研究可以歸化為兩大類：一是檢測(cè)糞便中腸道菌群譜及糞便揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)；二是測(cè)定血漿、糞便和尿液中的炎癥標(biāo)志物，如腸脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)、尿血清淀粉樣蛋白A(SAA)、糞鈣衛(wèi)蛋白(FC)、腸堿性磷酸脂酶(IAP)及血清C反應(yīng)蛋白(CRP)、腸三葉因子(ITF)、白介素(IL)-6、IL-8、IL-10等。作者著重就從糞便、尿液中尋找無(wú)創(chuàng)性分子標(biāo)志物用于早期診斷NEC的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 I-FABP

I-FABP是一種小的胞質(zhì)蛋白，主要存在于小腸的腸上皮細(xì)胞中，在細(xì)胞分裂后被釋放入血。I-FABP很容易從腎臟排出，因此可以在組織損傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)通過(guò)尿液檢測(cè)[2]。NEC的特點(diǎn)是腸壁完整性缺失，因此I-FABP也許是一種較有前途的生物標(biāo)志物。Gregory等[3]研究了70對(duì)病例與對(duì)照，NEC組發(fā)病7 d內(nèi)的尿I-FABP中位濃度均高于非NEC組。使用98例嬰兒(49對(duì)病例與對(duì)照)的一個(gè)子集進(jìn)行分析，其NEC組的尿樣均在診斷NEC的3 d內(nèi)獲得。其中，尿I-FABP中位濃度在NEC組中較高，并且在所有Bell分期中均顯著升高。受試者工作特征曲線(ROC曲線)顯示：在NEC發(fā)病的7 d內(nèi)，I-FABP>13.3 ng·ml-1預(yù)測(cè)NEC的敏感性為60%，特異性為78%；在NEC發(fā)病的3 d內(nèi)，I-FABP>13.9 ng·ml-1預(yù)測(cè)NEC的敏感性為65%，特異性為84%。由此認(rèn)為尿I-FABP可能是NEC發(fā)病的7 d內(nèi)一個(gè)有用的預(yù)測(cè)因子，在NEC發(fā)病的3 d內(nèi)更具有預(yù)測(cè)力。Schurink等[4]檢測(cè)了37例(男24例、女13例)新生兒的血漿I-FABP和尿I-FABP，發(fā)現(xiàn)NEC組(22例)的血漿I-FABP和尿I-FABP水平明顯高于非NEC組(15例)，I-FABP在發(fā)病后8 h內(nèi)最高，并隨著時(shí)間的推移逐漸下降。診斷NEC的臨界值為血漿I-FABP 9 ng·ml-1和尿 I-FABP 218 ng·ml-1。Coufal等[5]招募了42例疑似NEC的患兒和12例健康兒作為對(duì)照，通過(guò)ELISA檢測(cè)其尿液標(biāo)本，發(fā)展為NEC的患兒中，尿I-FAPA濃度在NEC早期就明顯升高，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)100%。然而，Yang等[6]對(duì)I-FABP用于NEC診斷相關(guān)的13個(gè)研究的結(jié)果進(jìn)行了Meta分析，認(rèn)為血漿I-FABP是診斷NEC的一種很有前途的生物標(biāo)志物，具有很高的特異性，但由于其敏感性中等，實(shí)用性受到了限制。而尿I-FABP和尿I-FABP/Cr對(duì)診斷價(jià)值不大，尿I-FABP聯(lián)合其他分子標(biāo)志物對(duì)高危早產(chǎn)兒的臨床應(yīng)用可能具有更大的應(yīng)用價(jià)值。由于目前實(shí)驗(yàn)中納入研究的樣本量都較小，因此需要更多高質(zhì)量的研究來(lái)確定I-FABP是否可成為早期識(shí)別NEC的分子標(biāo)志物。

2 SAA

SAA是一種急性期蛋白，在刺激性細(xì)胞因子誘導(dǎo)下由肝臟和腎臟迅速合成。Reisinger等[7]對(duì)62例臨床懷疑NEC的新生兒(29例最終診斷為NEC)進(jìn)行尿I-FABP、尿SAA、FC定量檢測(cè)。采用多變量Logistic回歸模型計(jì)算尿I-FABP+尿SAA和尿I-FABP+FC聯(lián)合應(yīng)用的診斷準(zhǔn)確率。結(jié)果顯示尿SAA聯(lián)合尿I-FABP不能提高尿I-FABP的診斷準(zhǔn)確率。隨后，Reisinger等[8]對(duì)這29例新生兒NEC進(jìn)行尿I-FABP、尿SAA、尿C3a、尿C5a和FC的測(cè)定，結(jié)果顯示，與輕度NEC(定義為內(nèi)科NEC或Ⅰ、Ⅱ期NEC)相比，嚴(yán)重NEC(定義為手術(shù)性NEC、致死性NEC或Ⅲ期NEC)新生兒尿SAA水平顯著升高。根據(jù)Bells修正標(biāo)準(zhǔn)，確定了Ⅱ期和Ⅲ期NEC組SAA的最佳臨界值為40.7 ng·ml-1。同一組還報(bào)道了尿SAA和血清血小板計(jì)數(shù)聯(lián)合應(yīng)用可將鑒定靈敏度提高到94%。這些結(jié)果提示，尿SAA可能是識(shí)別嚴(yán)重NEC的一個(gè)潛在標(biāo)志物，聯(lián)合血小板計(jì)數(shù)可提高SAA測(cè)定的準(zhǔn)確性。

3 FC

FC是一種由鈣和鐵合成的36 kDa的蛋白質(zhì)，可反映腸道炎癥情況。Yoon等[9]的研究結(jié)果示NEC組較非NEC組FC水平明顯升高。MacQueen等[10]隨訪了30個(gè)早期X線檢查排除NEC的患兒的糞便標(biāo)本，并根據(jù)其最終結(jié)局分組。結(jié)果顯示新生兒NEC組初診及隨訪FC水平均高于無(wú)NEC組。Zhang等[11]采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定早產(chǎn)兒NEC組(17例)和非NEC組(23例)的FC濃度，NEC組FC中位值明顯高于非NEC組，且NEC Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，F(xiàn)C水平與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與CRP呈正相關(guān)。無(wú)獨(dú)有偶，Abdelkader等[12]檢測(cè)了29例NEC患兒與29例非NEC患兒的糞便樣本，與非NEC組相比，NEC組FC水平高得多，且FC水平與NEC分期呈正相關(guān)。但也有一些研究者如Van Zoonen等[13]認(rèn)為，早產(chǎn)兒出生后的第1周FC濃度高，個(gè)體間差異大，廣泛的個(gè)體內(nèi)變異排除了在高危嬰兒NEC早期檢測(cè)或預(yù)測(cè)中連續(xù)使用FC的可能性。總之，F(xiàn)C可能是篩查高危新生兒亞群中NEC的一個(gè)有效的生物標(biāo)志物。然而，由于FC是一種非特異性炎癥標(biāo)志物，因此對(duì)NEC的診斷沒(méi)有特異性。但是將其與其他指標(biāo)相結(jié)合可能會(huì)增加其特異性。Reisinger等[7]對(duì)62例臨床懷疑NEC的新生兒(29例最終診斷為NEC)進(jìn)行尿I-FABP、尿SAA、FC定量檢測(cè)。采用多變量Logistic回歸模型分析尿I-FABP與FC聯(lián)合應(yīng)用的診斷準(zhǔn)確率。結(jié)果顯示FC和尿I-FABP的聯(lián)合應(yīng)用顯著提高了準(zhǔn)確性。尿I-FABP與FC聯(lián)合檢測(cè)的敏感性為94%，特異性為79%，但不能區(qū)分NEC Bell Ⅲ期和Bell Ⅱ期。由此可見(jiàn)，多種分子標(biāo)志物聯(lián)合用于診斷NEC的可行性可成為未來(lái)研究的一個(gè)重要方向。

4 VOCs

NEC炎癥標(biāo)志物的檢測(cè)目前主要集中在I-FABP、SAA、FC等，和腹部X線平片相比，糞便炎癥標(biāo)志物的檢測(cè)特異性比較差，多數(shù)處于臨床研究階段，沒(méi)有直接應(yīng)用于臨床診斷。目前臨床診斷NEC的主要方法還是依賴于腹部X線平片和腹部超聲檢查，這種檢測(cè)是基于腸道內(nèi)氣體產(chǎn)生量，特別是門(mén)靜脈內(nèi)的氣體含量。鑒于NEC臨床檢查以腸道內(nèi)氣體產(chǎn)生量為主要指標(biāo)，腸道內(nèi)某些揮發(fā)性有機(jī)化合物似乎有望成為診斷NEC的標(biāo)志物。De Meij等[14]認(rèn)為，從臨床癥狀出現(xiàn)前2～3 d起，NEC組(13例)的糞便VOCs譜可與非NEC組(14例)相鑒別，利用eNose進(jìn)行VOCs分析有可能成為早期預(yù)測(cè)NEC的非侵入性工具。Garner等[15]從新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)早產(chǎn)兒的每日糞便樣本(共65份)中提取了224種不同的揮發(fā)性有機(jī)物。非NEC組的VOCs數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)而增加，而NEC組診斷前后的幾天內(nèi)，VOCs的提取量減少。此外，在非NEC組中檢測(cè)到的4種特定酯(2-乙基己基乙酸酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯和十六酸乙酯)，在NEC發(fā)生前4 d內(nèi)的所有糞便樣本中始終未被檢測(cè)到。初步研究表明，從糞便中提取VOCs可用于鑒別NEC高危嬰兒。Probert等[16]從1 326例嬰兒中采集了7 000多份糞便標(biāo)本，并對(duì)32例確診NEC嬰兒診斷前的標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，NEC組和非NEC組的VOCs存在差異，在確診前3～4 d 似乎充當(dāng)了NEC的分子標(biāo)志物。但在確定個(gè)別揮發(fā)性有機(jī)化合物作為潛在的NEC分子標(biāo)志物的有用性之前，還需要更大的樣本量、進(jìn)一步的數(shù)據(jù)集驗(yàn)證。

5 糞便中腸道菌群譜

細(xì)菌在NEC的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，無(wú)菌動(dòng)物不能發(fā)展成NEC[17]。NEC患兒腸道菌群是否有其獨(dú)特性并能用于輔助診斷？許多研究者為此作了大量研究。Morrow等[18]檢測(cè)了11例NEC嬰兒和21例非NEC嬰兒的糞便和尿液樣本，認(rèn)為早期腸道微生物失調(diào)的特征和潛在益生菌的存在與否，可以作為非侵入性生物標(biāo)志物，共同預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒的NEC。結(jié)合早期的微生物因素，他們獲得了一個(gè)非常高的NEC預(yù)測(cè)值(88%)，但鑒于該研究的樣本量較小，且在單一人群中進(jìn)行，應(yīng)謹(jǐn)慎進(jìn)行這一初步估計(jì)。Zhou等[19]對(duì)取自12例NEC嬰兒和26例年齡匹配的非NEC嬰兒的共312個(gè)糞便樣本進(jìn)行了16sRNA基因的縱向分析，結(jié)果提示，腸道微生物中最常見(jiàn)的是腸桿菌屬，95%的樣本中都有腸桿菌，這表明該菌可能代表早產(chǎn)兒早期(0～60 d)的縱向核心屬。早期發(fā)病的NEC患者與對(duì)照組的微生物群的差異最為明顯。在接近NEC發(fā)病時(shí)，早期發(fā)病的NEC患者中，梭形芽孢桿菌的狹窄梭菌的豐度顯著高于對(duì)照組，晚期發(fā)病的NEC患者中，變形菌屬中的大腸桿菌/志賀氏菌在發(fā)病前呈上升趨勢(shì)，并在發(fā)病前6 d顯著高于對(duì)照組。晚期發(fā)病的NEC患者在發(fā)病前1～3 d，來(lái)自變形桿菌屬的阪崎腸桿菌也明顯高于對(duì)照組。因此，與NEC相關(guān)的特異性感染可能因嬰兒發(fā)病年齡的不同而不同。Warner等[20]研究了122例嬰兒的2 492份糞便樣本，其中28例嬰兒患NEC，94例非NEC嬰兒作為對(duì)照，NEC患兒糞便中的微生物群落結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比有顯著差異，這些差異只有在出生后的第1個(gè)月才出現(xiàn)。發(fā)展為NEC的嬰兒中，變形桿菌(腸桿菌科)的比例增加，陰性桿菌和梭菌-陰性桿菌的比例降低。這些關(guān)聯(lián)性在妊娠小于27周的嬰兒的隊(duì)列中最強(qiáng)。Roz′e等[21]對(duì)15例NEC患兒和57例非NEC患兒進(jìn)行了16sRNA基因測(cè)序，結(jié)果顯示，在屬級(jí)，梭狀芽孢桿菌與NEC顯著相關(guān)。Pammi等[22]通過(guò)系統(tǒng)回顧及Meta分析發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)兒患NEC前的微生物失調(diào)表現(xiàn)為變形桿菌相對(duì)豐度增加，厚壁菌和擬桿菌相對(duì)豐度降低。現(xiàn)有研究揭示了在屬級(jí)水平上早產(chǎn)兒患NEC前的腸道微生物失調(diào)，其結(jié)果是否能用于臨床診斷尚需進(jìn)一步研究。

6 IAP

IAP作為腸道內(nèi)表達(dá)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，是無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的理想選擇。Rentea等[23]利用新生大鼠模型證明早產(chǎn)及配方喂養(yǎng)與抑制IAP的表達(dá)和活性有關(guān)，而這兩者都可能增加NEC的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)有NEC風(fēng)險(xiǎn)的新生兒早期腸內(nèi)補(bǔ)充IAP可能有治療作用。Heath等[24]檢測(cè)了136例早產(chǎn)兒的糞便，分別用熒光法和免疫法測(cè)定IAP的酶活性和相對(duì)豐度，認(rèn)為糞便中IAP蛋白含量高、IAP酶活性低與NEC的診斷有關(guān)，可作為NEC的有用生物標(biāo)志物，并認(rèn)為IAP是唯一能夠區(qū)分NEC和敗血癥的生物化學(xué)物質(zhì)。

除上述無(wú)創(chuàng)性標(biāo)志物外，尿液來(lái)源的尿補(bǔ)體C3a和C5a[8]、前列腺素E2主要尿代謝物[25]以及糞便來(lái)源的糞乳鐵蛋白[26]等也有利于早期發(fā)現(xiàn)NEC。

近幾十年來(lái)，NEC分子標(biāo)志物研究取得了穩(wěn)步進(jìn)展。上述標(biāo)志物對(duì)早期診斷NEC、判斷其嚴(yán)重程度及治療方案選擇有一定的指導(dǎo)意義，但是目前尚無(wú)法確定一個(gè)比較準(zhǔn)確的診斷臨界值及其相關(guān)的敏感度、特異性，大樣本、多中心研究將是今后努力的方向。