王瀚萱，董家瀟，馬 穎，高 越，金永生 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004；. 解放軍第7 集團(tuán)軍醫(yī)院藥械科，浙江 湖州 000；. 煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心 、教育部分子藥理和藥物評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，山東 煙臺(tái) 64005）

近年來(lái)，真菌感染尤其是念珠菌感染日益嚴(yán)重，感染率居高不下[1]。并且由于免疫損傷以及長(zhǎng)期住院患者增多，又進(jìn)一步增加了機(jī)會(huì)性和系統(tǒng)性真菌感染的可能[2]。臨床上常見的抗真菌藥物如氟康唑等，由于真菌耐藥性和毒性等問題，限制了其使用。因此，研發(fā)新的抗菌藥物已經(jīng)成為迫切任務(wù)。

天然產(chǎn)物的抑菌作用受到了普遍關(guān)注，天然產(chǎn)物以其結(jié)構(gòu)新穎、生物活性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn)，成為了近年尋找抗真菌新藥及其先導(dǎo)化合物的研究熱點(diǎn)。沒食子酸（gallic acid，GA），又稱五倍子酸或棓酸，即3,4,5-三羥基苯甲酸，是一種存在于五倍子和漆樹等植物中的有機(jī)酸。文獻(xiàn)報(bào)道[3-7]其具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用。近期有研究[3]報(bào)道，沒食子酸于體內(nèi)外表現(xiàn)出較好的抗真菌作用。課題組以此為基礎(chǔ)，對(duì)沒食子酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成了系列沒食子酰哌嗪類化合物，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)了其單獨(dú)及協(xié)同抗真菌作用，為進(jìn)一步研究和開發(fā)沒食子類抗真菌化合物提供了基礎(chǔ)。

1 材料

所使用原料均為市售分析純或化學(xué)純?cè)噭：舜殴舱駳渥V（HNMR）和碳譜由Bruker AVANCE II 300 或 600 型核磁共振儀測(cè)得；質(zhì)譜（MS）由 QTof micro (ESI-MS)或Finingan LCQ Deca XP MAX質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 方法

2.1 化合物的合成

以三甲氧基沒食子酸為原料，在PyBOP/DIEA存在下與Boc 保護(hù)哌嗪或取代哌嗪縮合得到化合物4a～4h 或2，然后2 在HCl/乙酸乙酯溶液中脫Boc 得到三甲氧基沒食子酰哌嗪（3），3 再與不同取代苯甲酸在PyBOP/DIEA 條件下縮合得到化合物4i～4k。最后，4a～4k 采用 BBr3脫甲基得到目標(biāo)化合物1a～1k。具體合成路線見圖1。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線

2.1.1 4-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?哌嗪-1-羧酸叔丁醇酯（2）的合成

取三甲氧基苯甲酸 2.1 g（10 mmol），BOC 保護(hù)的哌嗪鹽酸鹽 2.2 g（12 mmol），PyBOP 7.8 g（15 mmol），DIEA 1.9 g（15 mmol），置入于 100 ml茄形瓶中，加入20 ml 干燥DMF，室溫?cái)嚢?～6 h，TCL 監(jiān)測(cè)反應(yīng)，待原料點(diǎn)消失后，將反應(yīng)液倒入到200 ml 冰水中，終止反應(yīng)，并繼續(xù)攪拌1 h。然后將析出的固體過濾，用乙醇重結(jié)晶，得到中間體3.1 g（8 mmol），收率80%。化合物4a～4h也采用此法合成。

2.1.2 1-(3,4,5-三甲氧基苯甲?；?哌嗪（3）的合成

取中間體（2）1 g（5.3 mmol），加入到 HCl-乙酸乙酯溶液中常溫?cái)嚢杓s3 h，TCL 監(jiān)測(cè)反應(yīng)，待原料點(diǎn)消失后過濾，烘干，得到中間體三甲氧基沒食子酰哌嗪（3）1.4 g，直接用于下一步反應(yīng)。

2.1.3 4-(2,3-二氯苯甲?；?-1-(3,4,5-甲氧基苯甲酰基)哌嗪的合成（4i）

取三甲氧基沒食子酰哌嗪（3）0.5 g（1.8 mmol）、2,3-二氯苯甲酸 0.35 g（1.85 mmol），其余方法同化合物2 的合成。得到目標(biāo)化合物 0.56 g（1.26 mmol），收率70%。化合物4j～4n 的合成均采用此法。

2.1.4 4-(2,3-二氯苯甲酰)-1-(3,4,5-三羥基苯甲酰)哌嗪的合成(1i)

取 4a 0.56 g（1.26 mmol），在無(wú)水、無(wú)氧條件下，置于100 ml 的三口瓶，加入20 ml 干燥二氯甲烷，然后降溫至（-20～-30）℃，加入 5 ml 2 mol/L 的三溴化硼二氯甲烷溶液，然后緩慢升溫至室溫，并攪拌反應(yīng)10 h。再將反應(yīng)液降溫至-10 ℃，然后緩慢加入200 ml 冰水猝滅反應(yīng)，再室溫?cái)嚢? h，如有固體析出，過濾。濾液用分液漏斗分出二氯甲烷層，并用 10 ml 水，洗 2 次，Na2SO4干燥，然后除去硫酸鈉，再除去溶劑，得到的固體和前面的濾餅合并，并經(jīng)乙醇重結(jié)晶，放置于烘箱烘干。得到最終產(chǎn)物 273 mg，收率（0.67 mmol）53%。其余 1 類化合物均采用此方法合成。

2.2 化合物的抗真菌活性測(cè)試

選用ATCC 標(biāo)準(zhǔn)株 Candida albicans 為質(zhì)控菌，臨床耐藥株Candida albicans 103 為實(shí)驗(yàn)菌株。氟康唑注射液（批號(hào)：A447404）購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司。采用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌敏感性實(shí)驗(yàn)方法[8]測(cè)試體外抗真菌活性，以目標(biāo)化合物MIC80作為判斷終點(diǎn)。

3 結(jié)果

共合成化合物11 個(gè)，經(jīng)檢索，均未見文獻(xiàn)報(bào)道。所有目標(biāo)化合物均經(jīng)1H NMR 和MS 確證結(jié)構(gòu)，相關(guān)理化數(shù)據(jù)見表1。目標(biāo)化合物的抗真菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

4 討論

目標(biāo)化合物采用PyBop/DIEA 條件下與相應(yīng)的哌嗪縮合而得到，該反應(yīng)操作和條件簡(jiǎn)便易行，收率較高。脫甲基保護(hù)采用三溴化硼的方法，副反應(yīng)少，收率較好。文獻(xiàn)報(bào)道了沒食子酸體外對(duì)敏感念珠菌的 MIC 值在 12.5～100 μg/ml[3]；體內(nèi)模式實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射 80 mg/（kg·d）可以顯著提高系統(tǒng)性真菌感染的治愈率[3]。因此，沒食子酸是一個(gè)較好的先導(dǎo)化合物?；钚詼y(cè)試所選用的2 株白色念珠菌臨床分離株均為耐藥菌株（氟康唑的MIC80＞64 μg/ml）。合成的目標(biāo)化合物中，所有沒食子酰哌嗪（1b，1d 和 1f）化合物無(wú)論單用還是聯(lián)用，均對(duì)2 株耐藥菌表現(xiàn)出較好的抗真菌活性，并且這些活性化合物在單用時(shí)MIC80≤64 μg/ml，均顯著優(yōu)于沒食子酸的抗真菌活性（MIC80＞64 μg/ml）。初步的構(gòu)效關(guān)系表明，沒食子酸的游離三羥基結(jié)構(gòu)是重要的藥效團(tuán)，如果羥基被保護(hù)起來(lái)，活性將會(huì)喪失。本研究結(jié)果為進(jìn)一步設(shè)計(jì)具有抗真菌作用的沒食子酸衍生物提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)及核磁共振圖譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)

表2 目標(biāo)化合物的體外抗真菌活性