程彩奕，鄧冬梅，王顯鳳，楊 征，幸海燕 （陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

顱內(nèi)感染尤其是多重耐藥菌感染具有進(jìn)展快、反應(yīng)重、治療難度大、病死率高的特點(diǎn)，故提高顱內(nèi)感染治愈率受到患者及臨床的廣泛關(guān)注。替加環(huán)素（TGC）作為首個(gè)甘氨酰四環(huán)素類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗耐藥活性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)臨床上常見耐藥菌（如鮑曼不動(dòng)桿菌、產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等）均有較好的療效[1]。在耐藥菌治療藥物不足的情況下，臨床醫(yī)生將TGC 用于顱內(nèi)感染的治療，此外，越來(lái)越多的案例報(bào)道稱，TGC 可有效清除致病菌[2-3]。

TGC 成功治療顱內(nèi)感染與腦脊液中有效藥物濃度密切相關(guān)，TGC 濃度監(jiān)測(cè)對(duì)于提高顱內(nèi)感染治愈率、精準(zhǔn)指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義[4]。本研究將利用二維液相色譜高效的自動(dòng)化在線樣品處理能力，建立腦脊液中TGC 濃度測(cè)定方法。該方法與已報(bào)道的質(zhì)譜法相比，具有操作簡(jiǎn)便、成本低、抗干擾能力強(qiáng)、基質(zhì)效應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)，腦脊液樣品無(wú)需復(fù)雜的前處理，高速離心后直接進(jìn)樣，短時(shí)間內(nèi)即可完成萃取、轉(zhuǎn)移及分析，更易于臨床推廣應(yīng)用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

二維高效液相色譜由FLC-2 701 全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）和LC-20A 色譜模塊（日本島津公司）構(gòu)成；-80 ℃冰箱（美國(guó)賽默飛科技公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯儀器公司）；渦旋混勻器（美國(guó)SI 儀器公司）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

TGC 對(duì)照品（北京百靈威科技公司，批號(hào): 10-MWV-62-1）；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；高氯酸、氨水為分析純；超純水自制。

1.3 空白腦脊液

入住神經(jīng)外科且未使用TGC 的患者，住院期間需開展腦脊液生化檢查時(shí)留取或從留置腰大池/腦室引流管中適量抽取。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取TGC 對(duì)照品1.29 mg，用20 mg/ml 精氨酸水溶液定容至100 ml 容量瓶中，即得12.90 μg/ml的TGC 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 樣品前處理

預(yù)處理方法考察時(shí)，取腦脊液樣品500 μl，直接離心、分別加入3 倍體積甲醇、乙腈、10%高氯酸沉淀蛋白，渦旋混勻5 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。最終確定預(yù)處理方法為: 腦脊液樣品13 000 r/min 離心10 min 后直接進(jìn)樣，采用外標(biāo)法定量分析。

2.3 色譜條件

第一維色譜柱LC1 為Aston SNX5 苯基色譜柱（50 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為磷酸銨（氨水調(diào) pH7.5）-甲醇 (45∶55，V/V），第二維色譜柱 LC2為 Aston SC5 C18色譜柱（275 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為磷酸銨（氨水調(diào)pH7.4）-磷酸銨（氨水調(diào)pH3.0）-乙腈（30∶50∶20，V/V/V），輔助流動(dòng)相為純化水。檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm，色譜柱溫40 ℃，進(jìn)樣量：200 μl，工作原理圖見圖 1，時(shí)間程序見表 1。

圖1 二維液相工作原理示意圖

表1 TGC 檢測(cè)時(shí)間程序

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性

分別制備空白腦脊液樣品、含TGC 的標(biāo)準(zhǔn)腦脊液樣品、患者用藥后的腦脊液樣品，進(jìn)行二維液相分析，得到色圖譜，觀察有無(wú)內(nèi)源性干擾，如圖2所示。結(jié)果表明，TGC 的出峰時(shí)間9.38 min，腦脊液的內(nèi)源性成分對(duì)TGC 的測(cè)定無(wú)干擾。

圖2 腦脊液中 TGC 色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系

取不同體積TGC 標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白腦脊液定容，配制成濃度為64.5、129.0、387.0、645.0、1 290.0 ng/ml 的系列對(duì)照溶液，按“2.2”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析。以TGC 濃度為自變量（X），腦脊液中TGC 的峰面積為因變量（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=116.32X-3 223.6（r=0.999 8）。結(jié)果表明TGC 濃度在64.5～1 290.0 ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為64.5 ng/ml。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度

分別配制含TGC 低、中、高及定量下限（225.0、450.0、900.0、64.5 ng/ml）4 個(gè)濃度的質(zhì)控（QC）腦脊液樣本，按“2.2”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析。1 d 內(nèi)每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份QC 樣品，連續(xù)測(cè)定3 d。將測(cè)得的峰面積代入“2.4.2”項(xiàng)下，計(jì)算各質(zhì)控樣品的濃度，并根據(jù)樣本實(shí)際濃度計(jì)算本法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果如表2 所示，日內(nèi)、日間RSD 均小于5%，準(zhǔn)確度均在98.80%～106.51%之間?？梢姳緦?shí)驗(yàn)所建立的二維液相色譜法測(cè)定腦脊液中TGC 的精密度和準(zhǔn)確度符合《中國(guó)藥典》（2015 年版）檢測(cè)要求[5]。

表2 腦脊液中測(cè)定 TGC 濃度的精密度與準(zhǔn)確度 (%)

2.4.4 穩(wěn)定性

配制“2.4.3”項(xiàng)下低、中、高及定量下限4 個(gè)濃度的QC 樣品，每個(gè)濃度平行3 份，分別考察室溫放置4 h、進(jìn)樣器放置6 h、反復(fù)凍融3 次、冰凍放置1 周后的穩(wěn)定性。結(jié)果如表3 所示，表明上述條件對(duì)TGC 的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響。

2.5 臨床應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)選取2 例接受TGC 治療的多重耐藥菌所致的重癥顱內(nèi)感染患者，腦脊液標(biāo)本藥敏試驗(yàn)均報(bào)告對(duì)TGC 敏感?；颊? 接受說(shuō)明書推薦劑量，即首劑靜脈滴注100 mg，后以50 mg 每12 h 維持治療?；颊? 同樣接受靜脈給藥，劑量為受試者1 的2 倍。達(dá)到穩(wěn)定藥物濃度后，留取兩位受試者的腦脊液，按“2.2”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析。受試者腦脊液中TGC 濃度分別為187.42、275.41 ng/ml。

3 討論

3.1 蛋白沉淀劑的選擇

甲醇、乙腈、10% 高氯酸是常用蛋白沉淀劑，本研究在空白腦脊液中分別加入3 倍體積上述沉淀劑，離心后與不加蛋白沉淀劑組比較，沉淀量無(wú)顯著差異，且所得上清液與沉淀完全分離?，F(xiàn)多項(xiàng)研究認(rèn)為，因腦脊液中蛋白質(zhì)含量低，故直接離心更利于生物樣品的微量分析[6]。另直接離心法進(jìn)樣，腦脊液中TGC 濃度無(wú)稀釋，也無(wú)其他前處理方法造成的誤差，更利于臨床樣本的分析。

3.2 臨床應(yīng)用

TGC 對(duì)G-菌（如流感嗜血桿菌、大腸桿菌、對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌等）MIC90為2～4 mg/L[7-8]。本試驗(yàn)中，無(wú)論是常規(guī)給藥還是加倍劑量給藥的患者，穩(wěn)態(tài)腦脊液濃度顯然均未起到殺菌作用，導(dǎo)致抗感染治療效果不佳。這可能與以下因素有關(guān)：①TGC相對(duì)分子質(zhì)量大而且水溶性強(qiáng)，很難進(jìn)入到腦脊液中。有研究報(bào)道在血腦屏障正常的志愿者中，腦脊液中TGC 濃度僅為血漿的11%。而對(duì)于腦膜炎患者，血腦屏障通透性可增至33%～52%，這可能也是靜脈注射TGC 成功治療顱內(nèi)感染的主要原因[9-10]，但血腦屏障破壞的程度個(gè)體差異較大。②重癥感染患者常伴有全身炎癥反應(yīng)、肝腎功能異常、多器官功能障礙綜合征等，血藥濃度低于正常水平，在同等穿透率的情況下，藥物從血液進(jìn)入腦脊液中的劑量減少[11]。③TGC 的蛋白結(jié)合率較高，為71%～87%[12]。顱內(nèi)感染時(shí)，腦脊液蛋白水平提高，使游離的藥物濃度降低[13]。④ 腦脊液引流量與藥物清除率呈正相關(guān)，引流量越大，腦脊液中的藥物濃度越低[14]。

表3 腦脊液中 TGC 在不同溫度條件下的穩(wěn)定性

目前，TGC 治療方案大多參照說(shuō)明書或文獻(xiàn)報(bào)道推薦劑量，未考慮血腦屏障、腦脊液引流量、給藥途徑等患者自身因素的影響，使顱內(nèi)TGC 的濃度不足、療效不佳。本研究建立的腦脊液中抗菌藥物TGC 的二維液相色譜分析方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，對(duì)促進(jìn)TGC 的合理使用、改善臨床治療結(jié)局具有重要意義。臨床可根據(jù)腦脊液中TGC 的濃度，及時(shí)調(diào)整給藥劑量或給藥途徑，提高治愈率，節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。此外，也為研究TGC 在顱內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及量效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。