馮 群，關(guān)永霞，黃志艷，葉士莉，程國(guó)良，姚景春,3，張貴民,3 （1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂76006；. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 76006；3. 山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 73400）

2019 年12 月，武漢市出現(xiàn)多例不明原因的病毒性肺炎病例，病例臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、咳嗽，少數(shù)病人腹瀉、嘔吐、呼吸困難，胸片呈雙肺浸潤(rùn)性病灶[1]。2020 年2 月11 日，世界衛(wèi)生組織將該病命名為新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），并稱引起該病的病毒為SARSCoV-2，與成年人相比，兒童更不易感染該病毒，65 歲以上老年人更易受感染[2]。目前全球疫情愈演愈烈，國(guó)內(nèi)用了兩個(gè)多月控制住疫情，中醫(yī)藥做出了巨大貢獻(xiàn)，但部分地區(qū)輸入性病例和無(wú)癥狀感染者不斷增加，尋找相應(yīng)的群體性配方，是當(dāng)前一項(xiàng)十分緊迫的研究任務(wù)。據(jù)古文獻(xiàn)記載，加上黃煌教授臨床經(jīng)驗(yàn)和近期的個(gè)案報(bào)道，建議可以采用兩首古代相傳的治療時(shí)令病的經(jīng)驗(yàn)成方——荊防敗毒散和十神湯，作為群體性預(yù)防用方[3]。

荊防敗毒散，出自《攝生眾妙方》，由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草等十一味中藥組成，已上市的中成藥包括荊防顆粒、荊防合劑。臨床研究表明，荊防敗毒散能緩解發(fā)熱、咳嗽、喘息與肺部啰音等作用，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子和細(xì)胞免疫狀況，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[4-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎的作用[7]。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出荊防敗毒散作用靶點(diǎn)，并進(jìn)行聚類分析，預(yù)測(cè)荊防敗毒散中核心活性成分，進(jìn)而運(yùn)用分析軟件對(duì)藥材-成分-靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接及信號(hào)通路分析，并預(yù)測(cè)其治療COVID-19 的作用機(jī)制，為荊防敗毒散用于預(yù)防及治療COVID-19 的可能性提供理論參考。

1 方法

1.1 荊防敗毒散成分的檢索與篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[8]，分別以荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、前胡、川芎、枳殼、茯苓、桔梗、甘草為關(guān)鍵詞搜索荊防敗毒散中的成分。本研究結(jié)合口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18），篩選收集到的化學(xué)成分，并結(jié)合《中國(guó)藥典》2015 年版中藥物的含量測(cè)定項(xiàng)對(duì)已篩選的成分進(jìn)行補(bǔ)充，最終建立荊防敗毒散的成分庫(kù)。

1.2 靶標(biāo)蛋白的篩選和成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)OB 和DL 篩選合格的成分，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其成分靶點(diǎn)進(jìn)行收錄。對(duì)未在TCMSP 中收錄靶點(diǎn)的成分，在PubChem 查詢成分對(duì)應(yīng)的Canonical SMILES 序列，并利用此序列在Swiss Target 數(shù) 據(jù) 庫(kù)[9]（http://www.swisstargetprediction.ch/）中對(duì)該成分的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，收集預(yù)測(cè)結(jié)果中的靶標(biāo)蛋白基因名稱。最后對(duì)收集的所有靶點(diǎn)在Unitprot 數(shù)據(jù)庫(kù)[10]（http://www.Unitprot.org/）輸入蛋白名稱并限定來(lái)源為Homo sapiens，獲取官方基因名作為荊防敗毒散的靶點(diǎn)庫(kù)。通過(guò)Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建荊防敗毒散藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析成分和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 COVID-19 靶點(diǎn)獲取

在CTD、NCBI 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“COVID-19”、“novel coronavirus pneumonia”等檢索詞檢索，檢索時(shí)間為2020 年7 月13 日。將檢索結(jié)果合并、去重，獲取新冠肺炎疾病相關(guān)基因，并把相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)作為藥物治療的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將荊防敗毒散成分的靶點(diǎn)與COVID-19 靶點(diǎn)分別導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取荊防敗毒散成分靶點(diǎn)和COVID-19 靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用（PPI）關(guān)系，通過(guò)Cytoscape 軟件Merge 功能，取兩者交集，挖掘關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 靶點(diǎn)的通路分析

為了進(jìn)一步了解上述篩選出的靶標(biāo)蛋白基因的功能及在信號(hào)通路中的作用，將篩選得到的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入 Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)[11]（https://metascape.org/），通過(guò)輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，進(jìn)行 GO（gene ontology）生物過(guò)程（BP，Biological Process）、細(xì)胞組成（CC，cellular component）、分子功能（MF，molecular function）富集分析和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號(hào)通路富集分析，并利用R 4.0.0 軟件將其結(jié)果可視化。

1.6 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

從 ZINC 數(shù)據(jù)庫(kù)[12]（http://zinc.docking.org/）下載Degree 值前10 成分的mol2 格式文件，用Autodock Tool 軟件打開該成分，使其能量最小化并判定成分的Root、選定可扭轉(zhuǎn)的鍵，保存為*pdbqt 格式文件。從 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)[13]（https://www.rcsb.org/）下載 SARS-CoV-2 3CL 水解酶（Mpro，PDB ID: 6LU7）和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 II（ACE2，PDB ID:1R42）的 3D 結(jié)構(gòu) PDB 格式文件[14-15]，運(yùn)用 Pymol軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子（如水分子），再保存為PDB 格式文件。隨后用Autodock Tool 軟件打開的PDB 文件，加氫、計(jì)算電荷并給蛋白添加原子類型（Assign AD4 type），將其保存為*pdbqt 格式文件[16]。

運(yùn)用Autodock Vina 將成分和受體對(duì)接。結(jié)合能小于0 說(shuō)明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，目前對(duì)于活性分子的靶點(diǎn)篩選尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本文根據(jù)結(jié)合能進(jìn)行排序，結(jié)合能數(shù)值的絕對(duì)值越大，對(duì)接結(jié)果較好，該成分可視為荊防敗毒散預(yù)防COVID-19 的潛在活性成分。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索荊防敗毒散各味藥的成分，并依據(jù)OB≥30%及DL≥0.18 要求，得到最終選定的結(jié)果為187 個(gè)不同的成分（28 個(gè)無(wú)已知靶點(diǎn)），其中荊芥11 個(gè)、防風(fēng)18 個(gè)、羌活15 個(gè)、獨(dú)活9 個(gè)、柴胡17 個(gè)、前胡24 個(gè)、川芎7 個(gè)、枳殼5 個(gè)、茯苓15 個(gè)、桔梗7 個(gè)、甘草92 個(gè)。篩選后的荊防敗毒散中部分活性成分的基本信息見(jiàn)表1。

2.2 藥材-成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 軟件進(jìn)行“荊防敗毒散藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，網(wǎng)絡(luò)共包括447 個(gè)節(jié)點(diǎn)（11 種藥材節(jié)點(diǎn)、159 個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、277 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和2 718 條邊，如圖1 所示，其中形狀“△”代表藥材，“〇”代表成分，“◇”代表基因，每條邊則表示藥材中所含成分及成分與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。性狀的大小代表Degree 值的大小。按照Degree值，排名前10 位的成分分別是槲皮素、山奈酚、木樨草素、漢黃芩素、β-谷甾醇、7-甲氧基-2 甲基異黃酮、丹參酮IIA、柚皮素、芒柄花黃素、異鼠李素。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并篩選得到COVID-19 相關(guān)的273 個(gè)靶點(diǎn)，將273 個(gè)疾病靶點(diǎn)和277 個(gè)荊防敗毒散活性成分的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到靶點(diǎn)PPI 關(guān)系，利用Cytoscape 軟件將兩者進(jìn)行Merge 取交集處理，得到包含55 個(gè)靶點(diǎn)和766 條邊的Hub 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。按照Degree 值從高到低，Hub 網(wǎng)絡(luò)中排名前10 位的靶點(diǎn)分別為MAPK3、TNF、IL6 、CASP3 、TP53 、MAPK8 、MAPK1、IL10、CCL2、MAPK14。

表1 荊防敗毒散中部分活性成分的基本信息

圖1 荊防敗毒散藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 荊防敗毒散干預(yù) COVID-19 的 Hub 網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 功能分析和KEGG 通路分析

通過(guò)Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的GO 功能富集分析得到GO條目1 376個(gè)（P＜0.01），其中BP條目1 304個(gè)，包括細(xì)胞因子和凋亡信號(hào)、刺激反應(yīng)、多生物過(guò)程、免疫過(guò)程、細(xì)胞代謝、生物進(jìn)程調(diào)控等；CC 條目19 個(gè)，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜、基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子等；MF 條目53 個(gè)，包括酶活性和酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性和結(jié)合能力、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白特異性結(jié)合等各類別分析中排名前20 位的條目，見(jiàn)圖3。

KEGG 通路富集分析篩選得到 136 條（P＜0.01）通路，涉及與寄生蟲、真菌、病毒感染引起的疾病通路有22 條（如朊病毒、甲型流感、人類嗜T 淋巴細(xì)胞病毒I 型感染、丙肝、肺結(jié)核、瘧疾、百日咳等）、癌癥相關(guān)的通路17 條（如非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、癌癥中碳代謝、轉(zhuǎn)錄失調(diào)等）、細(xì)胞進(jìn)程、免疫系統(tǒng)進(jìn)程、信號(hào)通路等。選Count 值較大的前20 條通路進(jìn)行可視化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.5 分子對(duì)接結(jié)果分析

將荊防敗毒散中排序前10 的核心成分分別與Mpro、ACE2 受體進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大，結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol 時(shí)則視為成分與靶點(diǎn)有較好的活性，結(jié)合能≤-29.336 kJ/mol 時(shí)則結(jié)合活性強(qiáng)烈[17]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，篩選出的荊防敗毒散核心成分與Mpro 結(jié)合能遠(yuǎn)小于-20.93 kJ/mol，與ACE2 受體結(jié)合能遠(yuǎn)小于-29.336 kJ/mol（見(jiàn)表 2）。選擇結(jié)合能均小于-29.336 kJ/mol 的β-谷甾醇、丹參酮IIA、芒柄花黃素，對(duì)其與Mpro、ACE2 的結(jié)合形式進(jìn)行分析，丹參酮IIA 可與Mpro 的110 位谷氨酰胺（GLN）和 ACE2 的 158 位絡(luò)氨酸（TYR）形成氫鍵（鍵長(zhǎng)20 nm 和22 nm）；芒柄花黃素可與Mpro 的 131 位精氨酸（ARG）和 287 位亮氨酸（LEU）分別形成氫鍵（鍵長(zhǎng) 27 nm 和 19 nm），與ACE2 的 615 位天冬氨酸（ASP）形成氫鍵（鍵長(zhǎng)22 nm）。氫鍵、疏水作用可能是荊防敗毒散成分與兩個(gè)受體主要的結(jié)合形式，結(jié)果見(jiàn)圖5。分子對(duì)接結(jié)果表明荊防敗毒散中活性成分與Mpro、ACE2結(jié)合活性較強(qiáng)，與后者的結(jié)合能力優(yōu)于前者。

圖3 荊防敗毒散成分作用靶點(diǎn) GO 功能分析

圖4 荊防敗毒散核心靶點(diǎn) KEGG 富集分析的前 20 條通路氣泡圖

表2 荊防敗毒散中核心成分與 Mpro、ACE2 的結(jié)合能

3 討論

突如其來(lái)的疫情給人類帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，人類必須努力了解疾病特點(diǎn)，盡快尋找到控制措施[18]。荊防敗毒散，由人參敗毒散去人參加荊芥、防風(fēng)而成。以荊芥、防風(fēng)，羌活、獨(dú)活發(fā)汗解表，開泄皮毛，使風(fēng)寒之邪隨汗而解，為通治一身風(fēng)寒濕邪的常用組合。柴胡、枳殼、桔梗調(diào)暢氣機(jī)，川芎行血合營(yíng)，羌活、茯苓化痰滲濕，三組合用，意在解表祛邪與疏通氣血津液。甘草調(diào)和藥性，祛風(fēng)散寒之力較強(qiáng)，宜于外感風(fēng)寒濕邪較重者。荊防敗毒散治退熱效果極佳，用于流行性感冒見(jiàn)效快[19-20]。新冠肺炎疫情屬于寒濕疫。因此，基于辨證論治的原則，荊防敗毒散可作為群體性預(yù)防用藥的選擇，并對(duì)初期輕癥（寒濕證）的新冠肺炎有一定治療效果。

根據(jù)KEGG 分析，得到136 條通路，包括感染性疾病通路、癌癥通路、細(xì)胞進(jìn)程通路、免疫系統(tǒng)通路、信號(hào)通路等。KEGG 前20 條通路中，頻率最高的靶點(diǎn)為RELA、MAPK1、MAPK3、TNF、IL6。RELA 在調(diào)節(jié)對(duì)感染的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，而且其磷酸化調(diào)節(jié)作用可抑制腫瘤的發(fā)生[21]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。TNF 在抗腫瘤、抗感染、免疫、炎癥等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[22]。結(jié)果表明荊防敗毒散呈現(xiàn)出中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)上述靶點(diǎn)的作用，調(diào)節(jié)感染類疾病通路、免疫損傷性、炎癥通路，起到防治COVID-19 的作用。

圖5 β-谷甾醇、丹參酮ⅡA、芒柄花黃素與 Mpro 和 ACE2 的分子對(duì)接圖

ACE2 是 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的 宿 主細(xì)胞受體，SARS-CoV-2 通過(guò)表達(dá)的S-蛋白與人體ACE2 結(jié)合，導(dǎo)致病毒入侵而致病，這可作為治療COVID-19 的突破口[23-24]。Mpro 是單正鏈 RNA 病毒前體多聚蛋白水解酶核心部分，將宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒RNA 翻譯成蛋白以產(chǎn)生子代毒，在RNA 復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中具有重要的作用[25-26]，抑制Mpro 活性將能阻止病毒的感染和復(fù)制。通過(guò)分子對(duì)接，這10 個(gè)成分與SARS-CoV-2 3CL 水解酶的結(jié)合能遠(yuǎn)小于-20.93 kJ/mol，與ACE2 受體的結(jié)合能遠(yuǎn)小于-29.336 kJ/mol，與二者結(jié)合最好的成分均為β-谷甾醇和丹參酮IIA，結(jié)合形式包括氫鍵、疏水作用。此外，槲皮素、山柰酚、異鼠李素也具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[27-28]。表明荊防敗毒散核心成分與COVID-19 相關(guān)蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合能力。

基于上述研究，荊防敗毒散對(duì)肺部疾病有一定的保護(hù)治療作用，能提高機(jī)體免疫力，對(duì)COVID-19 具有潛在的防治作用，可作為群體性預(yù)防用藥以及發(fā)病初期的治療。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的局限性，荊防敗毒散防治COVID-19 的效果有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。