方夏琴，檀華進(jìn)，譚曉川，李 鶴，張宇佳，鄭穩(wěn)生 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

目前全球尚無預(yù)防和治療新冠肺炎（COVID-19）確認(rèn)的特效藥物。有學(xué)者試圖遴選已有的抗病毒藥物，以期盡快開發(fā)“老藥新用”的治療方案。國家衛(wèi)生健康委員會陸續(xù)發(fā)布了7 版試行《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，其中，廣譜抗病毒藥物利巴韋林被作為可試用的臨床治療藥物。

利巴韋林（ribavirin）常用劑型有注射劑、片劑、口服液、氣霧劑等，國外臨床上多以霧化劑用于成人和兒童的呼吸道合胞病毒性肺炎的治療[1]。體外研究表明[2]，利巴韋林可增強(qiáng)干擾素的體外活性，在治療SARS-CoV 感染者中，診斷后立即使用利巴韋林時治療效果較好[3]。利巴韋林對DNA 和RNA 病毒均具有抑制作用，通常以霧化劑用于成人和兒童的呼吸道合胞病毒性肺炎的治療。美國食品藥品管理局（FDA）于1986 年首次批準(zhǔn)利巴韋林吸入溶液氣霧劑（Virazole?，USP）[4]，于 1992 年上市，而說明書中明確規(guī)定用于嚴(yán)重下呼吸道感染的住院患兒，且全程氣霧治療3～7 d，可見其應(yīng)用的嚴(yán)格限制。根據(jù)國內(nèi)多家臨床中心的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與利巴韋林顆粒劑相比，國內(nèi)的利巴韋林氣霧劑（信韋林）達(dá)到同等的治療效果時，雖然用藥劑量大幅下降，但不良反應(yīng)率無明顯差異[5-8]，表明利巴韋林吸入溶液氣霧劑（Virazole?，USP）和利巴韋林氣霧劑（信韋林）可能存在不良反應(yīng)較大的缺陷，臨床應(yīng)用受到一定的限制。

脂質(zhì)體定量吸入粉霧劑（DPI）是肺部給藥系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)之一。脂質(zhì)體由于類似細(xì)胞結(jié)構(gòu)而具有被動靶向性，作為藥物載體常用于肺部給藥，有利于抗病毒藥物直接遞送并作用于肺部細(xì)胞，抑制病毒的繁殖，特定粒徑的脂質(zhì)體粉霧劑可使藥物不同程度地的分布于人體上、下呼吸道，從而發(fā)揮更好的臨床治療效果[9-10]。利巴韋林水溶性較好，親脂性較差，如圖1 的結(jié)構(gòu)式所示，不易被細(xì)胞滲透吸收，采用脂質(zhì)體包裹，并制成粉霧劑給藥至呼吸道或肺泡組織，可實(shí)現(xiàn)肺部沉積增強(qiáng)的作用效果，同時降低不良反應(yīng)。本文根據(jù)臨床急需及利巴韋林的藥物理化性質(zhì)，結(jié)合吸入制劑肺部給藥方面的治療優(yōu)勢，設(shè)計研制了一種利巴韋林脂質(zhì)體吸入粉霧劑。以此開展設(shè)計研究，嘗試開發(fā)抗病毒藥物新型給藥系統(tǒng)，以期為擴(kuò)大利巴韋林臨床使用范圍，也為制劑學(xué)基礎(chǔ)研究提供參考。

圖1 利巴韋林化合物的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1200）；ME104E 電子天平（METTLER TOLEDO）；EYELA N-1000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）；Niro NS2006L高壓勻質(zhì)機(jī)（意大利GEA Niro Soavi 公司）；Nano NS90 粒度檢測儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Hitachi S-3400N 掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.2 材料

利巴韋林原料藥（純度＞98%，西安康諾化工有限公司）；利巴韋林對照品（629-200 202，中國食品藥品檢定研究院）；大豆卵磷脂（SPC）、脫氧膽酸鈉（SDC）（北京化學(xué)試劑公司）；N，N-二甲基甲酰胺、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 利巴韋林脂質(zhì)體凍干粉含量測定方法

參照美國藥典第40 版中“利巴韋林”含量測定方法[11]，采用高效液相色譜法測定。色譜條件：色譜柱為Carbomix H-NP5（7.8 mm×100 mm，5 μm）；流動相硫酸溶液調(diào)整 pH 至 2.5±0.1；流速：0.6 ml/min；柱溫：60 ℃；檢測波長 UV 207 nm；進(jìn)樣量 10 μl，取利巴韋林對照品適量，流動相溶解稀釋至濃度為0.025 mg/ml，過濾，進(jìn)樣檢測。取利巴韋林脂質(zhì)體凍干粉適量，加入無水乙醇少量破乳，呈透明溶液后流動相稀釋，制成濃度0.025 mg/ml 供試品溶液；同樣方式處理陰性樣品溶液。在該色譜條件下得到圖2 的色譜圖，圖中利巴韋林峰型較佳，出峰時間適宜，陰性對照無干擾。

2.2 利巴韋林脂質(zhì)體粉霧劑的制備

取大豆卵磷脂（5 mmol/L），脫氧膽酸鈉（5 mmol/L），為制備具有高穩(wěn)定性的雙分子膜，在處方中加入適量維生素E 置于250 ml 的茄形瓶中，加入無水乙醇溶解，超聲，至呈透明黃色溶液；將此溶液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑成膜；另取利巴韋林原料藥溶解于磷酸鹽緩沖液中（20 mg/ml），溶解完全后勻速加入至茄形瓶內(nèi)，并于40 ℃水浴溫度水化薄膜，直到完全水化呈近均一透明的乳白色溶液；高壓均質(zhì)機(jī)下將上述溶液均質(zhì)，即得到粒徑100～200 nm 的利巴韋林脂質(zhì)體溶液。加入凍干保護(hù)劑乳糖, 溶解搖勻后置西林瓶中，啟動冷凍干燥程序，即得疏松利巴韋林脂質(zhì)體凍干粉。

2.3 外觀形態(tài)

取載藥脂質(zhì)體經(jīng)處理后于透射電鏡下觀察，呈類圓形球狀物，直徑約200 nm，見圖3。

圖2 利巴韋林高效液相色譜圖（依次為空白樣品、對照品溶液、供試品溶液）1. 利巴韋林

圖3 自制利巴韋林脂質(zhì)體（左）透射電鏡圖與脂質(zhì)體凍干粉（右）高倍鏡圖

2.4 流動性、松密度

將粉末通過下孔徑為5 mm 的玻璃漏斗，從10 cm的高度緩慢、均勻地落入平板上，形成圓錐體。測量圓錐體的高度（h）和基底的半徑（r），按公式計算休止角（θ，tanθ＝h/r）。粉末休止角為 37～40°，流動性較好。取量筒，自由落體方式裝入脂質(zhì)體凍干粉，記錄質(zhì)量與體積，計算松密度約0.25 g/ml。

2.5 包封率、凍干粉含量測定

取利巴韋林脂質(zhì)體凍干粉適量，純化水溶解得脂質(zhì)體復(fù)溶物，取復(fù)溶物適量加入無水乙醇少量破乳，呈透明溶液后用流動相稀釋，制成0.025 mg/ml供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測凍干粉含量。

經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)對比，本研究采用Sephadex G-50柱層析法測定包封率。分別精密量取1 ml 脂質(zhì)體和凍干粉復(fù)溶物上柱，用純化水洗脫，流速0.5 d/s，從洗脫液由澄清變?nèi)榘咨_始收集至洗脫液再次變澄清（約15 ml），置50 ml 容量瓶中，以乙醇定容至刻度，振搖破乳；10 μl 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算包封藥物含量（W包）；另各取1 ml 脂質(zhì)體溶液及凍干粉復(fù)溶物置50 ml 容量瓶中，乙醇稀釋至刻度，振搖破乳，10μl 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算總藥量（W總）。以包封率=（W包/W總）×100%，計算結(jié)果見表1。

表1 利巴韋林脂質(zhì)體凍干粉含量與包封率

結(jié)果表明，按照初步擬定方法制得的脂質(zhì)體包封率約63%，凍干前后數(shù)據(jù)無明顯差別，復(fù)溶效果較好，載藥量較高，但包封率較低，處方工藝需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2.6 復(fù)溶液粒徑、聚合物分散指數(shù)與電位測定

取本品復(fù)溶液適量，純化水再次稀釋100 倍，于馬爾文粒徑儀檢測，如表2 所示，本品凍干前后溶液粒徑約160 nm，聚合物分散指數(shù)（PDI）、電位均較好，表明穩(wěn)定性較好。

2.7 凍干粉溶解性

脂質(zhì)體具有優(yōu)良的兩親性，凍干保護(hù)劑亦有很好的親水性。取本品凍干粉5 g 置10 ml 容量瓶中，加水10 ml，輕輕振搖即刻溶解完成，形成均一的乳白色膠束溶液，說明本品溶解性較好。

3 討論

病毒通過侵入人體呼吸道黏膜上皮細(xì)胞而感染，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，再釋放至細(xì)胞外感染宿主其他細(xì)胞，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過度免疫反應(yīng)。與一些在下呼吸道的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制繁殖的高致病性病毒類似，COVID-19 導(dǎo)致下呼吸道癥狀較為明顯。故若將抗病毒藥物遞送至下呼吸道，直達(dá)病灶，并進(jìn)入被感染的機(jī)體上皮細(xì)胞內(nèi)，可能更好地發(fā)揮抑制或清除病毒的作用。通常肺吸入給藥后可直接將藥物運(yùn)送至肺組織，在局部起效，與全身給藥治療肺部疾病相比較，可明顯減少藥物用量，降低藥物在其他部位分布與吸收造成的不良反應(yīng)，加之粉霧劑具備給藥劑量準(zhǔn)確、無需拋射劑、方便、易用及肺部靶標(biāo)部位藥物沉積量高等優(yōu)勢，是肺部疾病治療藥物較為理想的給藥途徑。

將利巴韋林通過脂質(zhì)體包裹技術(shù)實(shí)現(xiàn)粉霧劑肺部細(xì)胞靶向治療，相比普通口服與常規(guī)氣霧劑可減少用藥劑量和降低不良反應(yīng)，理論上具有一定的可行性。因而，對輕、中度COVID-19 感染患者也許是一種潛在的抗病毒藥物治療方式。

經(jīng)對利巴韋林脂質(zhì)體粉霧劑的初步制劑技術(shù)探究，結(jié)果證明制備的制劑滿足粉霧劑的基本要求。由于粉霧劑具有無需拋射劑、藥物相對穩(wěn)定的優(yōu)勢[12]，而且給藥裝置易于攜帶，操作簡單、給藥劑量相對準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，故適合開發(fā)研制成利巴韋林脂質(zhì)體吸入粉霧劑。此外，制備的利巴韋林脂質(zhì)體凍干粉還可開發(fā)為溶液氣霧劑，故在藥劑開發(fā)方面也有較好前景。然而，本實(shí)驗(yàn)尚為初步研究，仍需要對制劑處方工藝進(jìn)一步優(yōu)化，以進(jìn)一步提高包封率與改善整體粒徑分布等性能。如要進(jìn)入臨床試用，還需對給藥裝置篩選、體內(nèi)外藥物沉積、藥效學(xué)等進(jìn)行深入考察，以滿足臨床使用的基本要求。

表2 利巴韋林脂質(zhì)體凍干復(fù)溶液粒徑、PDI 與電位