王 玨 李竹英

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（哮喘）是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，具有較高的發(fā)病率及死亡率，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的全球性疾病。流行病學(xué)顯示，目前全球患病率達到1%～18%，其中發(fā)達國家的哮喘發(fā)病率10%～30%，而我國則為0.5%～5%[1-2]。劉建秋教授是全國名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師，從事呼吸系統(tǒng)疾病臨床工作40余載，運用中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病經(jīng)驗豐富。在哮喘慢性持續(xù)期的治療中，劉教授認(rèn)為“陽虛痰盛”乃其根本所在，故創(chuàng)立以“溫陽益氣，平喘化痰”為治法的中藥復(fù)方，研制成平喘顆粒。前期研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，平喘顆?？梢酝ㄟ^抑制哮喘大鼠肺組織中EGF mRNA的表達，增加外泌體中miR-23b的含量，調(diào)控Notch/STAT信號通路等方式改善氣道重塑，但其減輕哮喘氣道炎癥的具體機制尚不明確。嗜酸性粒細胞（EOS）是與哮喘炎癥反應(yīng)關(guān)系最為密切的效應(yīng)細胞，可以通過釋放顆粒蛋白、生長因子和炎性介質(zhì)等細胞因子引起哮喘的發(fā)生。EOS趨化因子（Eotaxin）和CC趨化因子受體3（CCR3）是EOS在肺內(nèi)募集的主要調(diào)控者，Eotaxin通過與EOS表面上特異性受體CCR3結(jié)合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，特異性募集、趨化和激活EOS，導(dǎo)致大量的EOS在氣道上皮及肺內(nèi)浸潤、聚集，從而誘導(dǎo)哮喘炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6]。本實驗通過觀察平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織中Eotaxin、CCR3表達的影響，探討平喘顆粒在治療哮喘炎癥方面的機制，為臨床應(yīng)用平喘顆粒治療哮喘提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8周齡健康清潔級雌性BALB/c小鼠30只，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，體質(zhì)量（20±2）g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±1）℃，濕度為45%～55%，自由進食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后再開始實驗。

1.2 試藥與儀器 卵清蛋白（OVA）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A107820）；Giemsa染色液（南京建成生物工程研究所，D010）；Eotaxin抗體（abcam，Ab133604）；CCR3抗體（abcam，Ab32512）；內(nèi)參抗體β-actin（santa cruz，sc-47778）；PVDF膜（密理博公司，IPVH00010）；Western及IP細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0013）；PMSF（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，ST506）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0011）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0015）。藥物：淫羊藿200 g，太子參 150 g，黃芪150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黃100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g。以上藥材加水煎煮2次，每2小時過濾1次，通過醇沉方式濃縮成稠膏[7]，相對密度為1.20～1.25（60℃），加入蔗糖、糊精適量制成1 000 g的顆粒劑，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，批號：20180723。按前期研究的最佳劑量（1.08 g/mL）含藥溶液灌胃，根據(jù)人體與動物的劑量折算，按照0.1 mL/10 g灌胃。超速冷凍離心機H-2050R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；-30℃恒冷低溫切片機CM69001，德國 Leica；水平搖床 WD-9405B、電泳儀DYY-7C、轉(zhuǎn)移槽DYCZ-40D和凝膠成像系統(tǒng)WD-9413B，北京六一儀器廠；超聲霧化機NB-150 U，歐姆龍自動化（中國）有限公司；-70℃超低溫冰箱DW HL-668，中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3 分組與造模 30只BALB/c小鼠，隨機分為3組，每組10只，分別是對照組、哮喘模型組、哮喘+平喘顆粒組。哮喘小鼠模型建立：根據(jù)文獻方法，應(yīng)用OVA致敏液[100 μg OVA+1 mg Al（OH）3]激發(fā) BALB/c小鼠，制備慢性哮喘小鼠模型。于實驗第1日、14日給予小鼠腹腔注射0.2 mL致敏液，22 d后進行霧化激發(fā)，霧化吸入1%OVA溶液，每次30 min，每周進行3次，連續(xù)激發(fā)8周[8]。

1.4 干預(yù)方法 各組實驗動物分別進行對應(yīng)處理：對照組腹腔注射及霧化吸入等體積生理鹽水代替OVA激發(fā)；哮喘模型組、哮喘+平喘顆粒組造成慢性哮喘動物模型。從第1次霧化激發(fā)的當(dāng)天開始，哮喘+平喘顆粒組每天灌胃給予平喘顆粒藥液0.1 mL/10 g，持續(xù)給藥8周，激發(fā)階段則每次激發(fā)前1 h灌胃；對照組和哮喘模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，灌胃時間同哮喘+平喘顆粒組。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 各組小鼠末次激發(fā)24 h后處死，向主氣管注射無菌生理鹽水0.5 mL，抽吸3次后將抽出的肺泡灌洗液（BALF）收集在1.5 mL離心管中備用。開胸取小鼠右肺的前葉及中葉部分，用液氮凍存后轉(zhuǎn)入-70℃超低溫冰箱中保存，以備Western blotting檢測。1）BALF中EOS數(shù)量測定：將回收的BALF在1 h內(nèi)于1 000×g，4℃離心，分離上清液，沉淀稀釋后制備細胞涂片，行瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡下計數(shù)200個細胞中EOS的數(shù)量，重復(fù)計數(shù)3次。2）Western blotting檢測：取凍存于-70℃的各組小鼠右肺的前葉及中葉部分，把組織切成非常細小的碎片，經(jīng)蛋白質(zhì)抽提、裂解、離心，提取小鼠肺組織總蛋白進行蛋白質(zhì)定量，按BCA蛋白試劑盒說明操作以檢測蛋白濃度，酶標(biāo)儀570 nm波長濾光片進行讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度及對應(yīng)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過回歸方程計算樣本蛋白濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即為樣本的蛋白濃度。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后用TBST緩沖液洗滌5 min，再浸入5%脫脂奶粉溶液中，緩慢搖動1 h后進行封閉及抗體孵育。孵育二抗后的PVDF膜繼續(xù)用TBST緩沖液洗滌6次，每次5 min。將化學(xué)發(fā)光試劑A、B等體積混合，均勻滴注于PVDF膜上，靜置反應(yīng)5 min，然后轉(zhuǎn)入暗盒中進行曝光。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的一般狀態(tài) 對照組小鼠毛發(fā)有光澤，反應(yīng)靈敏、活躍，食量、體質(zhì)量逐漸增加；呼吸頻率平穩(wěn)。哮喘模型組小鼠哮喘激發(fā)開始后，出現(xiàn)喘息、咳嗽癥狀，霧化激發(fā)時明顯，在不激發(fā)時也有咳嗽癥狀。隨著激發(fā)次數(shù)增多小鼠出現(xiàn)毛發(fā)蓬松、煩躁不安，活動減少，食量下降，體質(zhì)量增加緩慢。哮喘+平喘顆粒組小鼠用平喘顆粒干預(yù)后喘息、咳嗽癥狀較哮喘模型組輕，毛發(fā)有光澤，倦怠；食量較對照組少，但較哮喘模型組多；體質(zhì)量在干預(yù)前增加緩慢，干預(yù)后增加明顯。

2.2 各組小鼠BALF中EOS計數(shù)比較 見表1。與對照組比較，哮喘模型組和哮喘+平喘顆粒組小鼠BALF中EOS計數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與哮喘模型組比較，哮喘+平喘顆粒組小鼠BALF中EOS計數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠BALF中EOS計數(shù)比較（×104/mL，±s）

表1 各組小鼠BALF中EOS計數(shù)比較（×104/mL，±s）

與對照組比較，△P＜0.05；與哮喘模型組比較，?P＜0.05。下同

組別對照組哮喘模型組哮喘＋平喘顆粒組n 10 10 10 EOS計數(shù)0.05±0.01 3.84±0.85△1.85±0.58△*

2.3 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達比較見表2，圖1。與對照組比較，哮喘模型組和哮喘+平喘顆粒組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與哮喘模型組比較，哮喘+平喘顆粒組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白表達比較（±s）

組別對照組哮喘模型組哮喘＋平喘顆粒組n 10 10 10 Eotaxin 1.02±0.37 3.40±0.35△2.29±0.37△*CCR3 0.91±0.41 3.73±0.56△2.02±0.22△*

3 討 論

圖1 各組小鼠肺組織Eotaxin和CCR3蛋白的表達

哮喘是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，尚未完全闡明。哮喘發(fā)病過程中常伴隨著多種炎性細胞、細胞因子及炎性介質(zhì)的參與，其中EOS的地位至關(guān)重要。氣道炎癥是哮喘的病理變化基礎(chǔ)，其主要表現(xiàn)為EOS的浸潤、活化及其導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)。EOS活化后可以釋放大量的堿基蛋白、過氧化酶、陽離子蛋白等顆粒產(chǎn)物，這些顆粒產(chǎn)物具有很強的細胞毒性作用，可以引起氣道上皮組織水腫、脫落和壞死，血管通透性增高，黏液分泌增多等病理改變，產(chǎn)生氣道慢性炎癥和氣道的高反應(yīng)性，導(dǎo)致哮喘的發(fā)作[9]。EOS能夠激活機體內(nèi)其他的炎癥細胞，如巨噬細胞、淋巴細胞等，并且可以刺激EOS本身，促進多種炎性介質(zhì)的釋放，介導(dǎo)氣道內(nèi)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致哮喘的發(fā)生[10]。Eotaxin是一種選擇性的EOS趨化劑，對EOS有特異性的趨化作用，可以誘導(dǎo)EOS細胞質(zhì)肌動蛋白多聚化，吸引EOS向炎癥部位募集，黏附于內(nèi)皮細胞上，而對其他白細胞作用較弱，明顯區(qū)別于其他趨化因子。同時，Eotaxin還是一種有效的EOS激活劑，能夠激活EOS呼吸爆發(fā)并釋放氧自由基，促使EOS脫顆粒，釋放白三烯和組胺，從而導(dǎo)致氣道的炎癥反應(yīng)和高反應(yīng)性。研究顯示，哮喘小鼠外周血和肺組織中Eotaxin表達增強，其表達強度與BALF中EOS計數(shù)和哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，提示Eotaxin參與EOS的募集過程及其引起的炎癥反應(yīng)[11]。CCR3是一種表達于EOS上的受體蛋白，并且是Eotaxin的唯一受體。研究證實，Eotaxin對EOS的趨化作用95%是通過CCR3介導(dǎo)產(chǎn)生的[12]。CCR3還可以激活Th2類細胞，促進相關(guān)炎性因子的釋放，引發(fā)氣道炎癥。王濤等[13]研究發(fā)現(xiàn)CCR3拮抗劑SB2328437可以通過抑制哮喘小鼠氣道中CCR3和炎癥細胞的結(jié)合，下調(diào)BALF中IL4、TNF-α的表達水平，抑制氣道炎癥細胞浸潤，從而減輕哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。Eotaxin與CCR3特異性結(jié)合，可以產(chǎn)生一系列的信號通路傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄蛋白激活等生化反應(yīng)，選擇性地促進EOS向氣道黏膜遷移、聚集，進而誘導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生。李小波等[14]研究顯示Eotaxin通過與其受體CCR3結(jié)合可以促進CD34+細胞向EOS的分化，同時趨化EOS向外周血和支氣管黏膜聚集、浸潤，短期內(nèi)EOS急劇增加，引起支氣管平滑肌痙攣、氣管微血管通透性增加等反應(yīng)，從而誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥的發(fā)生。研究顯示，哮喘小鼠肺組織中Eotaxin、CCR3呈高表達狀態(tài)，并且在這種高表達狀態(tài)下，骨髓釋放的EOS和向外周血、肺組織遷移的EOS數(shù)目均明顯增多，提示Eotaxin、CCR3在EOS的活化、分化、趨化中發(fā)揮重要作用[15-16]。

平喘顆粒是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自制的中藥制劑，由淫羊藿、太子參、黃芪、五味子、知母、炙麻黃、款冬花、罌粟殼、地龍組成。方中淫羊藿、炙麻黃共為君藥，具有溫補腎陽、宣肺平喘之功；黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍共為臣藥，具有益氣助陽、潤肺生津、止咳平喘之功；罌粟殼斂肺止咳，為方中之佐藥；知母潤肺止咳，引方中諸藥歸經(jīng)，為方中之使藥。諸藥合用使腎陽得補，脾氣得健，肺氣得以宣暢，共奏溫陽益氣、化痰平喘之效。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可以通過下調(diào)EOS表面的CCR3 mRNA的表達，降低哮喘大鼠肺組織中Eotaxin的表達，抑制EOS的趨化反應(yīng)性，減輕EOS在氣道浸潤的嚴(yán)重程度，改善哮喘癥狀[17]。李中燕等[18]研究發(fā)現(xiàn)麻黃的主要成分麻黃堿可以通過抑制支氣管上皮細胞的Eotaxin表達減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。蔡萃等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪的主要活性成分黃芪甲苷可以通過降低哮喘小鼠血清中趨化因子Eotaxin的濃度和肺組織中CCR3及其mRNA的表達，抑制氣道中EOS的聚集，從而減輕哮喘小鼠肺組織的炎性損傷。

本實驗中我們應(yīng)用OVA致敏液制備慢性哮喘小鼠模型，哮喘模型組小鼠出現(xiàn)喘息、咳嗽、毛發(fā)蓬松、煩躁不安、活動減少等哮喘樣癥狀；且BALF中EOS計數(shù)增多；表明哮喘模型制備成功。研究結(jié)果顯示，平喘顆?？梢詼p少哮喘小鼠BALF中EOS計數(shù)，改善哮喘的炎癥反應(yīng)。鑒于Eotaxin、CCR3在EOS的趨化反應(yīng)中的重要作用，本實驗觀察了平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織中Eotaxin、CCR3蛋白表達的影響，結(jié)果顯示平喘顆?？梢砸种品谓M織中Eotaxin、CCR3蛋白的表達。綜上所述，平喘顆粒治療哮喘炎癥的作用機制可能與降低肺組織中Eotaxin、CCR3蛋白的表達，從而抑制EOS向氣道的聚集浸潤有關(guān)。