種婷

摘 要：食品安全是關(guān)系人民群眾生命、健康和社會(huì)穩(wěn)定的重大公共安全問題。自2014年開始，微生物污染就成為了食品安全領(lǐng)域的焦點(diǎn)問題，而這種現(xiàn)象與全球食品安全面臨的問題相吻合。近年來，沿海地區(qū)和內(nèi)陸食源性致病菌，特別是副溶血性弧菌引起的食物中毒發(fā)生率呈顯著上升的勢(shì)態(tài)，開發(fā)快速有效的副溶血性弧菌檢測(cè)技術(shù)意義重大。

關(guān)鍵詞：副溶血性弧菌;快速檢測(cè);MALDI-TOF-MS

Abstract：Food safety is a major public safety issue related to peoples life， health and social stability. Since 2014， microbial contamination has become the major focus in the field of food safety， and this phenomenon is consistent with the global food safety problems. In recent years， the incidence of food poisoning caused by food borne pathogens， especially Vibrio parahaemolyticus， has increased significantly in coastal and inland areas. It is of great significance to carry out rapid and effective detection of Vibrio parahaemolyticus.

Key words：Vibrio parahaemolyticus; Rapid detection; MALEI-TOF-MS mass spectrometer

中圖分類號(hào)：TS207.4

副溶血性弧菌是一種嗜鹽菌，主要分布在河口、海洋及沿海地區(qū)，是引起沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒的首要食源性致病菌，也是全國食源性疾病微生物病因的主要病因[1-2]。食品中副溶血性弧菌的檢測(cè)主要分為常規(guī)檢測(cè)和快速檢測(cè)兩種方法。常規(guī)檢測(cè)準(zhǔn)確、可靠，但周期較長，操作繁瑣，當(dāng)食源性疾病爆發(fā)時(shí)，無法快速鑒定出結(jié)果，無法滿足食品市場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。因此快速檢測(cè)技術(shù)得到越來越多食品檢測(cè)人的青睞，并且逐漸取得權(quán)威檢測(cè)機(jī)構(gòu)認(rèn)可，其中發(fā)展較快的有免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法等，這些新技術(shù)應(yīng)用于副溶血性弧菌的快速檢測(cè)中，不僅精確性高、特異性強(qiáng)，而且方便快捷，可以滿足現(xiàn)代快速檢測(cè)的需要。

1 副溶血性弧菌的免疫學(xué)檢測(cè)法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫法其主要原理是抗原和抗體的特異性反應(yīng)，載體上的酶與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過分光光度計(jì)對(duì)顯色反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。其特點(diǎn)是檢測(cè)快速、特異性好、通量高、靈敏度高，在食品副溶血性弧菌快速檢測(cè)中發(fā)揮了巨大作用。杜玉萍等[3]對(duì)不耐熱溶血素的基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其編碼的不耐熱溶血素蛋白進(jìn)行純化和表達(dá)，從不耐熱溶血素蛋白免疫小鼠中提取抗不耐熱溶血素抗體，同時(shí)利用大白兔的抗副溶血性弧菌抗體建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）雙抗體夾心法，直接測(cè)定該菌的致病性，從而間接反映出副溶血性弧菌的不耐熱溶血素基因具有較強(qiáng)的特異性，該方法檢測(cè)不耐熱溶血性毒素的靈敏度為8～10 μg·mL-1。檢測(cè)不耐熱溶血素的特異性基因可以為該菌的感染情況提供有力依據(jù)。

1.2 免疫層析法

免疫層析法將免疫法和層析法的優(yōu)勢(shì)有效結(jié)合，形成了一種更為簡(jiǎn)便快捷、精準(zhǔn)高效的檢測(cè)技術(shù)。免疫層析（ICTSs）探針主要有酶、膠體金、量子點(diǎn)脂質(zhì)體等。免疫膠體金技術(shù)主要原理是使抗原/抗體被載體包被，載體通常以微孔濾膜為主，將包被好的抗原/抗體加入到待測(cè)樣品中，通過載體的毛細(xì)作用，使待測(cè)樣品中的抗原/抗體與載體中的抗體/抗原結(jié)合，再與膠體金標(biāo)記物結(jié)合，從而被聚集在檢測(cè)帶上。向輝等[4]采用抗體與標(biāo)記的磁性熒光納米顆粒相結(jié)合的免疫層析技術(shù)對(duì)副溶血性弧菌TDH基因進(jìn)行檢測(cè)，特異性較高，濃度范圍為1～105 CFU·mL-1，比測(cè)定產(chǎn)葡萄球菌腸毒素B的金黃色葡萄球菌試紙條的靈敏度提高了100倍。

2 副溶血性弧菌的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR法

實(shí)時(shí)熒光PCR又稱RT-PCR，其原理是通過高溫將模板基因裂解成單鏈，然后退火，兩條引物分別與單鏈上的一段序列結(jié)合，在聚合酶的催化作用下，以單鏈DNA為模板利用底物合成新的DNA片段，然后再次循環(huán)解鏈、退火延伸，從而達(dá)到擴(kuò)增的目的。底物中加入了熒光基團(tuán)，儀器通過采集熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)系統(tǒng)。聞潔等[5]建立了復(fù)合探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌tlh基因進(jìn)行檢測(cè)。無需增菌狀態(tài)下，樣品含菌量為103 CFU·g-1（或103 CFU·mL-1）時(shí)即可檢出。增菌6 h時(shí)，只需1 CFU·g-1（或1 CFU·mL-1）的副溶血性弧菌即可檢出。該方法快速準(zhǔn)確靈敏度高，大大縮短檢驗(yàn)周期。

2.2 多重PCR法

多重PCR是在同一體系里加入2對(duì)以上引物，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)基因。蔣蔚等[6]采用多重PCR法針對(duì)groEL基因特異性擴(kuò)增VP644bp目標(biāo)片段，可同時(shí)分離霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌，檢出限可達(dá)102 CFU·mL-1。高世光等[7]采用雙重?zé)晒釶CR法對(duì)副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，最低檢出限達(dá)到20 CFU·mL-1，100%特異度。Hossain MT等[8]建立的多重PCR可同時(shí)對(duì)特異性基因（tlh）和毒力基因（tdh和 trh）進(jìn)行檢測(cè)，既能檢測(cè)出副溶血性弧菌的總量又能檢測(cè)出具有致病性的副溶血性弧菌數(shù)量。

2.3 LAMP法

日本學(xué)者Notomi T [9]于2000年在Nucleic Acids Res上公開環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），該方法具有反應(yīng)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，不需要特殊儀器，肉眼即可觀察結(jié)果等特點(diǎn)，適合基層快速診斷。相興偉等[10]針對(duì)副溶血性弧菌rox R基因和霍亂弧菌omp W基因建立一種雙重LAMP法，可同時(shí)對(duì)副溶血性弧菌和霍亂弧菌進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)60份海鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示檢出限達(dá)到3.12 fg，并且與其他菌株無交叉反應(yīng)，100%特異性。模擬食品樣品檢出限達(dá)到50 CFU·mL-1。Malcolm TTH等[11]檢測(cè)海產(chǎn)品時(shí)同時(shí)采用多重PCR法和LAMP法進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)目標(biāo)菌含量比較高時(shí)兩種方法區(qū)別不大，當(dāng)含有痕量目標(biāo)菌時(shí)LAMP比多重PCR靈敏度更高，具有明顯優(yōu)勢(shì)。

3 MALDI-TOF-MS檢測(cè)技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）是食源性疾病鑒定和檢測(cè)的新技術(shù)。1988年，質(zhì)譜和裂解技術(shù)初次聯(lián)合應(yīng)用于細(xì)菌鑒定，此后利用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)微生物的序幕被逐漸拉開。質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的主要原理是將基質(zhì)化合物與經(jīng)過預(yù)處理的待測(cè)樣品按照一定的比例混合，使待測(cè)物質(zhì)均勻分散在基質(zhì)化合物中。在脈沖激光的激發(fā)下基質(zhì)分子被電離產(chǎn)生大量氫離子，氫離子轉(zhuǎn)移到樣品分子中，使其解析或電離，氣化后的樣品形成帶電離子。但在這一過程中，并沒有化學(xué)鍵的斷裂，只形成了多聚體。通過對(duì)多肽離子的采集和分析，得到圖譜并與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比，從而鑒定和區(qū)分菌種種類。

Ryan T Saffert等[12]用BD公司的Phoenix自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)和Bruker公司的Biotyper MALDI-TOF-MS系統(tǒng)對(duì)440株革蘭氏陰性菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，自動(dòng)生化鑒定儀在屬水平和種水平上的準(zhǔn)確率分別為83%和75%，MALDI-TOF-MS在屬水平和種水平上鑒定的準(zhǔn)確率分別為93%和82%。MALDI-TOF-MS和自動(dòng)生化鑒定儀鑒定常見菌株屬水平的準(zhǔn)確率均能達(dá)到95%，對(duì)于不常見的菌株可鑒定到屬水平，兩者準(zhǔn)確率分別為85%和52%，有顯著差異。由此可見MALDI-TOF-MS對(duì)不常見革蘭氏陰性菌的鑒定有顯著優(yōu)勢(shì)。Mcelvania TeKippe E等[13]對(duì)239株革蘭氏陽性菌采用MALDI-TOF-MS法進(jìn)行鑒定。其中220株鑒定屬水平的準(zhǔn)確率達(dá)92.1%，181個(gè)分離株中167株鑒定到種水平的準(zhǔn)確率達(dá)92.2%。Bruker公司的MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫有2 371個(gè)菌株，包含革蘭氏陰性菌、蘭氏陽性菌、酵母菌、絲狀真菌與分枝桿菌革蘭氏陽性等。菌株數(shù)據(jù)庫還在不斷增加和完善，質(zhì)譜檢測(cè)會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。

4 展望

傳統(tǒng)檢測(cè)副溶血性弧菌的方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)檢測(cè)人員要求高，不能滿足快速檢測(cè)的需要。因此，免疫學(xué)和分子生物學(xué)已經(jīng)成為快速檢測(cè)的主流。隨著新技術(shù)的發(fā)展，未來將是各項(xiàng)技術(shù)融合優(yōu)化、聯(lián)合使用，如免疫磁珠與PCR聯(lián)用技術(shù)、免疫磁珠與LAMP聯(lián)用技術(shù)[14]、液相芯片與多重PCR聯(lián)用技術(shù)等[15]。MALDI-TOF-MS以快速、高通量和未知菌鑒定等特點(diǎn)成為近年發(fā)展起來的微生物快速鑒定檢測(cè)技術(shù)，在歐美等發(fā)達(dá)國家已經(jīng)發(fā)展到較為成熟的階段，在我國還處于起步階段。我國已經(jīng)發(fā)布了關(guān)于MALDI-TOF-MS檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)，隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步深入，MALDI-TOF-MS將會(huì)成為未來快速檢測(cè)中不可或缺的重要手段。

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