耿慧娟

【摘要】目的 觀察分析布魯氏桿菌對巨噬細胞容易感染原因。方法 采用同組體外培養(yǎng)的巨噬細胞進行分組，并分別采用抑制劑3-MA與自噬激活劑雷帕霉素對于巨噬細胞進行處理，并預(yù)留一組不做處理，分為巨噬細胞組、3-MA組與雷帕霉素組，處理完成后進行綠色熒光表達的重組豬種布魯氏菌接種，并在接種完成后對于兩組細胞內(nèi)部的巨噬細胞數(shù)量與布魯氏菌數(shù)量進行對比，觀察兩種細胞數(shù)量變化與細胞內(nèi)LC3-II的含量變化。結(jié)果 在出現(xiàn)布魯氏菌感染后，巨噬細胞發(fā)生了一定的自噬作用，雷帕霉素組巨噬細胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯上升且高于其他組;同時雷帕霉素組內(nèi)的布魯氏菌數(shù)量明顯高于另外兩組，而在2 h、6 h、12 h、24 h四個時間段內(nèi)對比我們發(fā)現(xiàn)，各組的布魯氏菌數(shù)量均出現(xiàn)上漲的情況，且隨著時間的推移巨噬細胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯增加。結(jié)論 在布魯氏菌感染巨噬細胞的過程中，巨噬細胞體內(nèi)的LC3-II的含量會出現(xiàn)明顯上升，提示自噬作用的發(fā)生，但是隨著時間的推移，此種自噬作用雖然能夠殺滅部分布魯氏菌，但是也會使得布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)部出現(xiàn)增殖的情況，當(dāng)達到感染數(shù)量飽和時，巨噬細胞將無法抑制布魯氏菌的大量增殖。

【關(guān)鍵詞】布魯氏桿菌;巨噬細胞;雷帕霉素;3-MA;LC3-II;自噬作用

【中圖分類號】R37 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.28..02

細胞的自噬過程是一種細胞基于自我消化與降解的高度保守行為，多是由于真核細胞生物體內(nèi)為維持機體的環(huán)境穩(wěn)定所進行的一種過程[1]。同時自噬行為的發(fā)生往往也是機體內(nèi)部固有的免疫應(yīng)答重要標志，在進行自噬的過程中，會對于機體內(nèi)部細胞中存在的病原體進行有效的清除，同時也能夠在抗原的提呈過程中起到一定的作用[2]。但是近年來有一些文獻指出[3]，自噬雖然能夠有效的對于外來入侵的病原體與微生物進行有效的殺滅與清除，但是部分胞內(nèi)寄生菌與病毒往往能夠通過自身或者機體對于自噬作用進行一定的改變或者逃避，甚至進而在機體內(nèi)借助大量增殖，引發(fā)相關(guān)疾病。本次研究中的布魯氏菌就是一種主要寄生與巨噬細胞與胎盤滋養(yǎng)層細胞內(nèi)部的包內(nèi)寄生革蘭氏陰性菌種，此類菌種能夠通過其表面的O-鏈LPS對于巨噬細胞表面脂伐產(chǎn)生一定作用，進而進入巨噬細胞內(nèi)部，改變內(nèi)部pH值的同時，使自身大量繁殖[4]。但是對于自噬細胞遭受相關(guān)感染的原因與在感染過程中是否存在一定的抑制布魯氏菌增長的作用一直未曾明晰。本次研究中巨噬細胞進行分組，并分別采用抑制劑3-MA與自噬激活劑雷帕霉素對于巨噬細胞進行處理，并預(yù)留一組不做處理，觀察分析布魯氏桿菌對巨噬細胞容易感染原因，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選取的重組豬種布魯氏菌與小鼠巨噬細胞等實驗材料均來源于外院實驗室采購保存，研究中所采用的相關(guān)實驗材料有：LC3-II抗體試劑、3-MA抑制劑、自噬誘導(dǎo)劑Ra、LC3-IIELISA檢測試劑盒。

1.2 實驗方法

具體實驗方法如下：①首先進行重組豬種布魯氏菌與布魯氏菌的培養(yǎng)，均按照1%的比例于培養(yǎng)基中接種，隨后37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后進行收獲并置于冰箱內(nèi)保存與菌落計數(shù);②隨后將巨噬細胞進行常規(guī)傳代培養(yǎng)并置于96孔細胞培養(yǎng)板中，2×106個/孔，直至細胞長至單層，隨后選擇終濃度為10nM的Ra與10nM的3-MA進行作用，作用2h后棄細胞液并加入培養(yǎng)基，單孔100uL/孔;③將培養(yǎng)好的布魯氏菌以1∶500的比例接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，并分為巨噬細胞組、3-MA組與雷帕霉素組，隨后進行培養(yǎng)在2 h、6 h、12 h、24 h四個時間段加入蛋白酶抑制劑，并隨后進行3此低溫凍融;④對于標本進行離心5 min并取上清液，進行LC3-II含量測定。

1.3 觀察指標

對比三組兩種細胞數(shù)量變化與細胞內(nèi)LC3-II的含量變化。

2 結(jié) 果

2.1 檢測結(jié)果一覽

在出現(xiàn)布魯氏菌感染后，巨噬細胞發(fā)生了一定的自噬作用，雷帕霉素組巨噬細胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯上升且高于其他組;同時雷帕霉素組內(nèi)的布魯氏菌數(shù)量明顯高于另外兩組;而在2 h、6 h、12 h、24 h四個時間段內(nèi)對比我們發(fā)現(xiàn)，各組的布魯氏菌數(shù)量均出現(xiàn)上漲的情況，且隨著時間的推移巨噬細胞內(nèi)的LC3-II的含量明顯增加，見表1、2。

3 討 論

本次研究中所提及的布魯氏菌能夠通過一系列的策略逃避免疫監(jiān)視，從而改善巨噬細胞內(nèi)部的環(huán)境，從而使得其內(nèi)部有利于其自身的復(fù)制與增殖。國內(nèi)有研究認為胞內(nèi)病原微生物主要能夠通過抑制自噬小體的形成或者抑制吞噬小體與溶酶體的融合來干擾機體內(nèi)部自噬作用的發(fā)生，本次研究中采用了3-MA與雷帕霉素對于巨噬細胞的自噬能力進行了放大或者降調(diào)，且并為對于巨噬細胞的活力造成影響，同時基于自噬能力的大小對于布魯氏菌生長的影響進行了對比，發(fā)現(xiàn)了兩者之間的關(guān)聯(lián)性[5]。

同時本次研究中對于細胞內(nèi)LC3-II的表達量進行了一定的測定，此類指標的含量往往是反映細胞內(nèi)部自噬作用能力的重要指標，通過對于此指標的測定能夠有效的測定自噬作用與布魯氏菌的關(guān)聯(lián)性[6]。我們發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌感染后巨噬細胞內(nèi)LC3-II的表達量明顯增加，并對于巨噬細胞的自噬能力進行了有效的增強，同時也導(dǎo)致了布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)部的增殖，隨著實驗時間的推進我們不難發(fā)現(xiàn)，隨著細胞內(nèi)LC3-II的表達量下降，細胞內(nèi)部的布魯氏菌數(shù)量卻一直在增加，主要是由于在細胞數(shù)量有限的情況下，當(dāng)布魯氏菌的數(shù)量飽和后，自噬細胞雖然啟動了自噬作用，LC3-II為溶酶體降解，并使得布魯氏菌被部分殺滅，但是存留的布魯氏菌已然在其內(nèi)部大量增殖，這也解釋了布魯氏桿菌對巨噬細胞容易感染的原因所在。

綜上所述，在布魯氏菌感染巨噬細胞的過程中，巨噬細胞體內(nèi)的LC3-II的含量會出現(xiàn)明顯上升，提示自噬作用的發(fā)生，但是隨著時間的推移，此種自噬作用雖然能夠殺滅部分布魯氏菌，但是也會使得布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)部出現(xiàn)增殖的情況，當(dāng)達到感染數(shù)量飽和時，巨噬細胞將無法抑制布魯氏菌的大量增殖。

參考文獻

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[2] 鄧肖玉，易繼海，李啟峰，等.泛素相關(guān)修飾蛋白SUMO-2對RAW264.7細胞內(nèi)布魯氏菌16M存活的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2019，46（8）：2257-2264.

[3] 許 達.馬耳他布魯氏菌OmpR基因缺失株的構(gòu)建及其對布魯氏菌生長與復(fù)制的影響[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2018，40（12）：1105-1111.

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[6] 王 成，向 導(dǎo)，田 艷，等.一例布魯氏桿菌病的緊急流行病學(xué)調(diào)查報告[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2018，22（8）：122.