時小淋,王曉豐，劉 鵬,程艷杰，王明義

(1.大連醫(yī)科大學附屬威海市立醫(yī)院a中心實驗室; b消化內(nèi)科，山東威海 264200;2. 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科， 遼寧大連 116000 )

在人體血液循環(huán)中約70%的白細胞為中性粒細胞，正常人骨髓每天可生成大量、新鮮的中性粒細胞[1]，作為先天免疫系統(tǒng)的“先頭部隊”，其在機體抵御病原微生物的入侵中起著重要作用[2]。中性粒細胞“身兼”著趨化、吞噬、殺菌等多種功能，在機體被病原體感染后，能在多種趨化因子的作用下，逐漸向感染部位遷移，并通過多種途徑對病原體進行誘殺，因此其免疫調(diào)節(jié)作用不容忽視[3]。目前普遍認為中性粒細胞的殺菌機制主要包括：活性氧殺菌途徑、脫顆粒殺菌途徑和胞外殺菌網(wǎng)絡(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)途徑[4]。若殺菌途徑缺陷或被抑制， 機體會發(fā)生反復感染；但若盲目加強殺菌作用，其過度激活也會損傷機體，引起多種自身免疫性疾病等，因此本文就中性粒細胞殺菌機理的最新研究進展作以綜述，以期為后續(xù)中性粒細胞過度激活后的作用途徑以及靶點的研究提供理論基礎。

1 活性氧殺菌途徑

1.1 活性氧殺菌途徑的組成 中性粒細胞的活性氧殺菌途徑可大致分為兩種：一種是由髓過氧化物酶(MPO)，H2O2和血漿或細胞內(nèi)的Cl-，I-(鹵族化合物)組成；另一種是由于6磷酸葡萄糖氧化旁路(HMP)的代謝加快，O2在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶作用下接受NADPH上的一個電子后，還原為超氧物陰離子(·O2-)，生成氫氧自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)[6]。其中·O2，·OH，H2O2和1O2又被稱為活性氧(ROS)[7]。

1.2 活性氧殺菌途徑的作用機理 中性粒細胞的活性氧殺菌途徑，總體來說指的是ROS的殺菌作用以及MPO與H2O2在鹵族元素等因子的作用下形成醛后形成的高效殺菌作用[5]。

被病原體激活后的中性粒細胞會發(fā)生“呼吸爆炸”，耗氧量增加至數(shù)倍甚至數(shù)十倍[5-6]，宿主細胞吞噬病原體時，中性粒細胞質(zhì)膜部分內(nèi)陷，將病原體吞入細胞后形成吞噬小體，由于局部質(zhì)膜的構象改變，導致原本無活性的NAD(P)H氧化酶被激活，然后催化氧分子變?yōu)椤2-[5-7]?！2-又在脂質(zhì)上形成過氧化物而破壞生物膜?！2-除了能直接攻擊細菌外，其在細胞內(nèi)還能形成·OH，1O2和H2O2等物質(zhì)[7]?！H，1O2都是作用強烈的氧化劑，不僅可以氧化蛋白中的某些氨基酸殘基和碳水化合物，更能分解核酸，對致病菌也有極大的殺傷作用。而H2O2本身就有殺菌作用，還能與·O2-生成OH，1O2加強殺菌效果[8]。此外，中性粒細胞中含有的大量MPO能與H2O2，鹵族元素共同發(fā)揮殺菌作用，被稱為過-過-鹵系統(tǒng)，其作用機制是使氨基酸氧化脫羧，產(chǎn)生氨、醛類，同時造成病原體表面的氧化和鹵化，肽鏈被分裂，病原體的蛋白質(zhì)結構破壞[5]。

2 脫顆粒殺菌途徑

2.1 脫顆粒殺菌途徑的組成 中性粒細胞內(nèi)存在很多與殺菌有關的顆粒，分別為嗜天青顆粒、特異性顆粒和三級顆粒。中性粒細胞特有的顆粒為嗜天青顆粒，不僅含有大量MPO，還有一系列具有殺菌作用的中性粒細胞絲氨酸蛋白酶(NSPs)-組織蛋白酶G(CG)、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、蛋白酶3(PR3)和其他殺菌物質(zhì)[3-5]。特異性顆粒則含有乳鐵蛋白、溶酶體等。溶酶體中又有大量水解酶、溶酶蛋白等物質(zhì)。三級顆粒的特點是含有明膠酶[8-9]。

2.2 脫顆粒殺菌途徑作用機理 中性粒細胞的脫顆粒殺菌途徑主要指的是上述顆粒及其內(nèi)容物在殺傷致病菌中的作用[10]。已有文獻表明，NE不僅可破壞外膜蛋白A直接殺滅大腸埃希菌，還能裂解福氏志賀氏菌的某些遷移蛋白，防止福氏志賀氏菌進入細胞內(nèi)。與此類似，CG能裂解金黃色葡萄球菌的黏附因子A。PR3則能切割hCAP-18生成抗菌肽LL-37。而在體內(nèi)，NE，CG和PR3共同發(fā)揮協(xié)同作用殺滅吞噬液泡內(nèi)的肺炎鏈球菌[11-12]。乳鐵蛋白不僅能結合鐵元素減少細菌對鐵的吸收，影響細菌的生長，還可與細菌細胞壁的脂多糖結合，將細菌氧化使其裂解，還能夠針對H+-ATP酶并干擾胞膜上的質(zhì)子傳遞，從而對微生物造成致命的威脅[13-14]。此外，乳鐵蛋白還能夠參與ROS的產(chǎn)生[15]。溶酶體的抗菌譜雖窄，但是它能水解作為細菌細胞壁的組成成分的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的肽鏈，以起到對某些革蘭氏陽性菌的殺傷作用[5]。

3 胞外殺菌網(wǎng)絡途徑

3.1 胞外殺菌網(wǎng)絡途徑的組成 中性粒細胞的NETs最初是由BRINKMANN等[16]發(fā)現(xiàn)。核酸物質(zhì)及顆粒蛋白構成了NETs，DNA是NETs的主體部分，構成了骨架以固定各種蛋白。嗜天青顆粒、特異性顆粒和三級顆粒，構成了顆粒蛋白[17]。

3.2 胞外殺菌網(wǎng)絡途徑的作用機理 NETs是以“自殺式”的模式殺滅病原體來保護機體，中性粒細胞的染色質(zhì)發(fā)生伸展、凝聚解體，核膜崩解后DNA及殺菌顆粒物質(zhì)釋放、黏附在解凝聚狀態(tài)的染色質(zhì)上，最終核膜破裂、中性粒細胞死亡，NETs被釋放出來[18]。

NETs的殺菌作用機制主要是通過以下兩點發(fā)揮作用的：①DNA形成的特殊骨架結構能限制或延緩病原體在宿主體內(nèi)的傳播，起到了物理屏障作用；還能減少殺菌物質(zhì)的彌散，發(fā)揮了類似“富集”的效應，增加了局部殺菌物質(zhì)的濃度；②中性粒細胞含有的各級顆粒也釋放出各種殺菌蛋白[19]。值得一提的是，NETs的殺菌作用是在中性粒細胞的吞噬作用開始前就已啟動，且在細胞死亡之后繼續(xù)發(fā)揮作用[20]。已有文獻報道，NETs能夠殺滅多種細菌、真菌，甚至是寄生蟲[21]。有趣的是，相關實驗發(fā)現(xiàn)，ROS的存在是NETs生成的前提[22]。

4 中性粒細胞殺菌途徑的缺失或抑制

中性粒細胞活性氧殺菌途徑在宿主抵抗致病菌侵襲的過程中發(fā)揮著重要作用，一旦此項殺菌功能缺失，將導致機體抵抗外界感染能力的銳減[23]。如人類遺傳病慢性肉芽腫(chronic granulomatous disease，CGD)，其特點是由于NADPH氧化酶的某種成分缺失而導致ROS的產(chǎn)生缺乏，所以CGD患者的中性粒細胞的吞噬作用和脫顆粒功能雖正常, 但不能以正常速度殺死宿主細胞所吞入的細菌等，病人常出現(xiàn)頻繁而致命的感染[24]。

中性粒細胞脫顆粒殺菌途徑若缺失或被抑制，殺菌能力也將銳減。帕-勒氏綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome，PLS)是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，其患者在出生一年后就表現(xiàn)出對細菌感染的發(fā)生率增加，相關研究發(fā)現(xiàn)，PLS患者的NSPs嚴重降低，患者的體外殺菌能力減弱[25]。慢性粒細胞白血病(CML)患者因其嗜天青顆粒和吞噬空泡不能發(fā)生融合，以至于無法產(chǎn)生H2O2，殺菌能力大幅度下降；而骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)患者部分或完全缺失顆粒內(nèi)含酶，這也是CML和MDS患者易被病原體感染的原因之一[5]。

多項實驗證實，NETs骨架可被脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)降解，能避免病原體被NETs捕捉殺滅[22,26]。BEITER等[26]人發(fā)現(xiàn)含有DNase的肺炎鏈球菌較普通菌株更易從上呼吸道擴散到肺和血液當中而引起肺炎，體外實驗證明用DNase抑制劑抑制了DNase的活性后，病原體的致病性明顯降低[22]。

5 中性粒細胞殺菌途徑的過度激活

中性粒細胞殺菌功能受損時，機體易受感染，但當中性粒細胞被過度激活時，也會損傷組織，引起多種疾病[23]。對患有哮喘的大鼠肺組織進行切片、染色后觀察，發(fā)現(xiàn)其支氣管壁及血管壁周圍MPO陽性的細胞明顯增多，說明MPO參與了哮喘的發(fā)病[27]。當機體內(nèi)ROS含量增加后，氧化應激狀態(tài)即加重，機體血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，誘導多種細胞因子的產(chǎn)生，這些因子在RA的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[28]。此外，ROS升高后將導致DNA氧化、結構改變，這會誘導自身抗體產(chǎn)生，進而誘發(fā)SLE等疾病[29]。

中性粒細胞產(chǎn)生的過多NSPs也會對機體組織造成損傷，α1抗胰蛋白酶是人體內(nèi)重要的內(nèi)源性NSPs抑制劑，它能有效地抑制NE，CG的活性，其缺失與慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生密切相關[30]。DABEK等[31]人發(fā)現(xiàn)CG與潰瘍性結腸炎的發(fā)病相關，CG可以使腸上皮細胞頂側的蛋白酶激活受體-4(PAR-4)得到激活進而導致上皮屏障被破壞，促進炎癥反應的發(fā)生。

NETs雖然有著強大的殺菌功能，但當NETs生成的同時也會產(chǎn)生大量的自身抗原，若不及時去除也能對機體造成損傷[2]。囊性纖維病患者痰液中含有大量的DNA和彈性蛋白，在對患者采取吸入DNase療法后，患者的癥狀和肺功能得到了改善，提示NETs可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關[32]。流感病毒引起肺炎時，刺激中性粒細胞產(chǎn)生的NETs，在破壞肺泡后引起肺泡毛細血管的彌漫性損傷，造成肺水腫，引起急性呼吸窘迫綜合征樣病理征象[2]。

6 展望

中性粒細胞是人體抵抗外界感染的重要免疫細胞，可以吞噬殺滅入侵的致病病原體，通過“呼吸爆發(fā)”、脫顆粒、NETs等途徑對病原體進行誘殺，因此其免疫調(diào)節(jié)作用不容忽視。若中性粒細胞殺菌途徑缺陷或受抑制，將導致機體發(fā)生反復且嚴重的感染，甚至致死。但若盲目加強中性粒細胞的殺滅病原體作用，以至于中性粒細胞被過度激活后，也會損傷機體，造成各種自身免疫性疾病等，但是對于中性粒細胞過度激活后具體的作用途徑以及作用靶點目前還尚未完全明確，因此對于明確此點對感染性疾病的治療具有極大的指導意義。因此臨床對于中性粒細胞的殺傷作用應該合理利用，以達到對人體的最優(yōu)利用。