王林 王熙 季楠 李海梅 蔡世新

1.衡水市人民醫(yī)院口腔正畸修復(fù)科，衡水 053000；2.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院口腔教研室，承德 067000

牙齒發(fā)育不良是指患兒的上下牙齒對(duì)位不良，影響日常生活，通常采用正畸治療[1-2]，主要通過(guò)牙齒矯形器，給予適當(dāng)?shù)?、持續(xù)的力量，使牙位移動(dòng)，從而達(dá)到矯正效果[3-4]。既往研究[5-6]主要集中于分析牙周膜的作用，即牙周膜組織在持續(xù)應(yīng)力刺激下可以不斷的形成新的骨性結(jié)構(gòu)，促進(jìn)牙槽骨的改建，從而達(dá)到矯形的目的，但是具體的機(jī)制尚未明了。

近年來(lái)，隨著人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSC）的分離成功，研究的熱點(diǎn)主要集中于牙周膜干細(xì)胞的成骨分化方面[7-8]。本研究以hPDLSC為研究對(duì)象，構(gòu)建體外機(jī)械牽張應(yīng)力細(xì)胞模型，以新型機(jī)械激活性離子通道壓電蛋白Piezo1為切入點(diǎn)，構(gòu)建Piezo1蛋白的過(guò)表達(dá)載體和siRNA干擾載體，從過(guò)表達(dá)Piezo1蛋白和抑制Piezo1蛋白兩個(gè)方向上探究Piezo1蛋白在hPDLSC向成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制。以成骨基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt相關(guān)基因2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（os teocalcin，OCN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）為成骨的標(biāo)志物[9-12]，探究Piezo1在促進(jìn)hPDLSC成骨分化方面的作用。

1 材料和方法

1.1 hPDLSC的分離、培養(yǎng)

選取2016年1月1日—2018年1月1日就診于北京兒童醫(yī)院正畸科的8～14歲兒童因阻生而拔出的年輕恒牙的牙周膜組織為細(xì)胞來(lái)源，研究方案通過(guò)北京兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并通過(guò)，取得兒童直系監(jiān)護(hù)人的知情同意授權(quán)書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有兒童均無(wú)活動(dòng)性牙齒感染，細(xì)胞均來(lái)源于因阻生而拔出的恒牙牙周膜組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：有明顯牙周炎或感染癥狀的患兒。

收集牙周膜組織后采用酶消化法提取hPDLSC。采用眼科剪和無(wú)菌刀片刮取牙周膜組織，用預(yù)熱的PBS溶液沖洗3次，加入Ⅰ型膠原蛋白酶消化處理50 min，置于37 ℃恒溫箱中，每5 min搖晃一次，使牙周膜組織與膠原蛋白酶充分混合，常溫離心機(jī)3 000 r·min-1離心5 min，棄掉上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，然后接種于25 cm×25 cm的Flask’s培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃，15%CO2濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代干細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 hPDLSC的鑒定

本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)角蛋白（pan-cytokeratin）、波形蛋白（vimentin）的表達(dá)。選取第3代hPDLSC作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，以2×104細(xì)胞量接種于預(yù)先鋪有無(wú)菌圓形玻璃板的24孔板中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，15%CO2濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的PBS溶液沖洗3次，加入4%多聚甲醛孵育20 min，PBS溶液沖洗3次，加入0.4%Triton X-100孵育5 min，PBS溶液沖洗3次，5%BSA封閉20 min，加入一抗（pan-cytokeratin，vimentin兔抗人一抗），4 ℃低溫水箱孵育過(guò)夜，PBS溶液沖洗3次，加入二抗（山羊抗兔CY3二抗）孵育10 min，使用DAB工作液進(jìn)行染色。

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)hPDLSC的標(biāo)志物CD146和STRO-1進(jìn)行鑒定，收集第3代hPDLSC細(xì)胞，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度控制在每毫升3×107個(gè)；加入5支EP管，每管100 μL，加入一抗體系：STRO-1兔抗人一抗，CD146兔抗人一抗，STRO-1和CD146的同型對(duì)照單抗以及PBS空白對(duì)照，加入到5支EP管中，4 ℃低溫避光孵育20 min，PBS漂洗，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面蛋白CD146和STRO-1。

1.3 siRNA-Piezo1干擾載體的構(gòu)建

siRNA-Piezo1干擾載體的構(gòu)建和篩選由上海吉?jiǎng)P公司完成。首先通過(guò)Pubmed Genebank查詢(xún)?nèi)嗽碢iezo1蛋白的基因序列以及ORF序列和3’-UTR序列。根據(jù)siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，構(gòu)建siRNA-Piezo1的干擾序列。設(shè)計(jì)3種干擾序列，具體如下。siRNA-Piezo1-homo-3299：GCGTCATCATCGTGTGTAAGA；siRNA-Piezo1-homo-5762：GCCTCAAGTACTTCATC ATCAACT；siRNA-Piezo1-homo-1875：GCGTCT TCCTTAGCCATTACT。選取上海吉?jiǎng)P公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對(duì)象，加入siRNA-Piezo1干擾序列后，轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，進(jìn)行克隆測(cè)定，然后進(jìn)行質(zhì)粒的抽提、慢病毒的包裝以備用。

1.4 Piezo1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

Piezo1基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和篩選由上海吉?jiǎng)P公司完成。首先對(duì)目的基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)引物設(shè)計(jì)，Piezo1（4589-11）序列為：ACGGGACTAAGCGCATTGCAATTTCC。然后逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）擴(kuò)增目的基因序列，將目的基因擴(kuò)增序列加入線性化表達(dá)載體，選取上海吉?jiǎng)P公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對(duì)象，加入Piezo1基因過(guò)表達(dá)載體序列后，轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，進(jìn)行克隆測(cè)定，然后進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，慢病毒的包裝以備用。

1.5 應(yīng)用Flexcell 4000T機(jī)械牽張應(yīng)力儀器構(gòu)建體外牽張力學(xué)hPDLSC細(xì)胞模型和細(xì)胞分組

將hPDLSC接種于Flexcell公司的BIO膜性六孔板中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合率達(dá)50%時(shí)，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行“同位化”處理，孵育過(guò)夜后，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將膜性六孔板加載Flexcell 4000T機(jī)械牽張應(yīng)力儀器，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即牽張應(yīng)力作用時(shí)間為12 h對(duì)細(xì)胞的牽張應(yīng)力作用最明顯，所以選取12 h牽張應(yīng)力進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置六孔板形變量為15%，每分鐘6個(gè)循環(huán)。

本實(shí)驗(yàn)分成5組：空白對(duì)照組：不加載機(jī)械牽張應(yīng)力；牽張應(yīng)力組：加載12 h機(jī)械牽張應(yīng)力；陰性對(duì)照組：加載12 h機(jī)械牽張應(yīng)力，并且轉(zhuǎn)染空白無(wú)序序列的慢病毒轉(zhuǎn)染hPDLSC（不含有功能質(zhì)粒的慢病毒）；siRNA干擾組：加載12 h機(jī)械牽張應(yīng)力，并且轉(zhuǎn)染siRNA-Piezo1干擾序列的慢病毒轉(zhuǎn)染hPDLSC；過(guò)表達(dá)組：加載12 h機(jī)械牽張應(yīng)力，并且轉(zhuǎn)染Piezo1過(guò)表達(dá)序列的慢病毒轉(zhuǎn)染hPDLSC。

1.6 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)Piezo1、Notch1和成骨基因的表達(dá)

利用胰蛋白酶收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液清洗3次，常溫離心機(jī)1 500 r·min-1離心5 min，取沉淀，加入1 mL Trizol溶劑，提取細(xì)胞總RNA，保證RNA純度范圍為1.8～2.1，然后利用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，采用20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存，采用TAKARA熒光定量PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒）的要求，采用FTC-2000 RT-qPCR系統(tǒng)和50 μg反應(yīng)體系對(duì)樣本DNA進(jìn)行分析，溶解曲線確定Tm值為53.7 ℃，統(tǒng)計(jì)并記錄各組樣本的CT值，采用2-△△CT法對(duì)Piezo1基因和成骨基因OCN和BSP的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。Piezo1、OCN、BSP和內(nèi)參基因磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物設(shè)計(jì)由上海生工公司設(shè)計(jì)并檢測(cè)合格（表1）。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.7 Fluo-3 AM探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量

利用胰蛋白酶收集上述各組細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液清洗3次，接種于預(yù)先鋪有細(xì)胞圓形玻璃爬片的24孔板，加入不含鈣離子的培養(yǎng)基，孵育24 h，采用Hank’s平衡鹽溶液清洗3次，加入預(yù)先1∶5稀釋的Fluo-3 AM工作液，避光孵育30 min，樹(shù)膠封片，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量。

1.8 Western blot檢測(cè)成骨標(biāo)志蛋白ALP和Runx2的表達(dá)

預(yù)冷處理各組細(xì)胞，經(jīng)PBS溶液清洗3次，加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，收集入1.5 mL離心管中，4 ℃、5 000 r·min-1離心5 min（離心半徑為3 cm）后取上清，95 ℃煮沸后，收集蛋白備用。制備濃縮膠10 mL，分離膠20 mL。上樣后（每孔上樣量為20 μL）電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用BSA封閉，封閉的時(shí)間為30 min，封閉后PBST溶液洗膜，重復(fù)3次，加入一抗（兔抗人）（ALP、Runx2、OCN和BSP）1∶10 000稀釋后加入樣本離子膜（孵育的溫度為4 ℃，時(shí)間為＞12 h）；第二天用PBST稀釋液洗膜3次，加用山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）稀釋后孵育1.5 h（孵育溫度為37 ℃），用PBST稀釋液洗膜3次，用DAB顯影液處理樣本。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白灰度，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間Piezo1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量、蛋白表達(dá)量、鈣離子含量等比較采用方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)，認(rèn)為P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSC的鑒定結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，hPDLSC波形蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hPDLSC標(biāo)志物STRO-1表達(dá)陽(yáng)性，CD146表達(dá)陽(yáng)性（圖1、2）。

圖1 hPDLSC的鑒定 免疫組織化學(xué)染色Fig 1 Identi fication of hPDLSC immunohistochemical staining

2.2 RT-PCR篩選3種序列的Piezo1 mRNA表達(dá)結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組中Piezo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.25±0.02），siRNA-Piezo1-homo-3299序列，siRNA-Piezo1-homo-5762序列和siRNA-Piezo1-homo-1875序列中Piezo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.03±0.02、0.22±0.01、1.17±0.03，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.009，P=0.000）；并且siRNA-Piezo1-homo-5762與另外2組相比，Piezo1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.021，3.548，P＜0.05）。

2.3 siRNA-Piezo1干擾序列和Piezo1過(guò)表達(dá)載體序列轉(zhuǎn)染hPDLSC的結(jié)果

空病毒載體、siRNA-Piezo1干擾序列和Piezo1過(guò)表達(dá)載體序列均可以通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染hPDLSC，而且轉(zhuǎn)染效率較高，均在90%（圖3）。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig 2 The results of the flow cytometry

圖3 siRNA-Piezo1干擾序列和Piezo1過(guò)表達(dá)載體序列轉(zhuǎn)染hPDLSC 倒置熒光顯微鏡 × 400Fig 3 The siRNA-Piezo1 interference sequence and Piezo1 overexpression vector sequence were transfected into hPDLSC inverted fluorescence microscope × 400

2.4 RT-PCR檢測(cè)Piezo1、Notch1和成骨基因的表達(dá)

siRNA干擾組、過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組、牽張應(yīng)力組和陰性對(duì)照組Piezo1 mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.573，P＜0.05）。過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組Piezo1 mRNA表達(dá)水平明顯高于siRNA干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.893，P＜0.05；q=2.113，P＜0.05）。牽張應(yīng)力組Piezo1 mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.006，P＜0.05），但是與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.208，P＞0.05）（圖4A）。siRNA干擾組、過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組、牽張應(yīng)力組和陰性對(duì)照組Notch1 mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.003，P＜0.05）。過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組Notch1 mRNA水平明顯高于siRNA干擾組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.991，P＜0.05；q=2.463，P＜0.05）。牽張應(yīng)力組Notch1 mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.331，P＜0.05），但是與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.188，P＞0.05）（圖4B）。成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的表達(dá)也有同樣的趨勢(shì)（圖4C～F）。

圖4 RT-qPCR檢測(cè)Piezo1、Notch1和成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的表達(dá)結(jié)果Fig 4 The expression of piezo1, Notch1, ALP, Runx2, OCN and BSP were detected by RT-qPCR

2.5 Western blot檢測(cè)成骨標(biāo)志蛋白ALP和Runx2的表達(dá)

Western blot檢測(cè)成骨標(biāo)志蛋白ALP和Runx2的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖5。siRNA干擾組、過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組、牽張應(yīng)力組和陰性對(duì)照組ALP蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.207，P＜0.001）；過(guò)表達(dá)組和空白對(duì)照組ALP蛋白表達(dá)水平明顯高于siRNA干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.991，P＜0.05；q=2.451，P＜0.05）；牽張應(yīng)力組ALP蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.007，P＜0.05）。但是牽張應(yīng)力組ALP蛋白表達(dá)水平與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.451，P＞0.05）。

siRNA干擾組、過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組、牽張應(yīng)力組和陰性對(duì)照組Runx2蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.473，P＜0.001）；過(guò)表達(dá)組和空白對(duì)照組Runx2蛋白表達(dá)水平明顯高于siRNA干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.499，P＜0.05；q=3.568，P＜0.05）；牽張應(yīng)力組Runx2蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.661，P＜0.05）。但是牽張應(yīng)力組Runx2蛋白表達(dá)水平與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.328，P＞0.05）。

2.6 細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)結(jié)果

siRNA干擾組、過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組、牽張應(yīng)力組和陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)組、牽張應(yīng)力組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于siRNA干擾組。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示siRNA干擾組、過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組、牽張應(yīng)力組和陰性對(duì)照組鈣離子熒光強(qiáng)度分別為102.03 μm±15.02 μm、473.57 μm±34.37 μm、158.29 μm±10.55 μm、247.98 μm±11.45 μm、259.23 μm±10.24 μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.009，P＜0.05）。過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于siRNA干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.571，P＜0.05；q=2.336，P＜0.05）；牽張應(yīng)力組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.124，P＜0.05）。但是牽張應(yīng)力組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.995，P＞0.05）。

圖5 Western blot檢測(cè)ALP和Runx2的表達(dá)Fig 5 The expression of ALP and Runx2 was detected by Western blot

圖6 細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)結(jié)果Fig 6 The result of the intracellular calcium

3 討論

既往有文獻(xiàn)[13]報(bào)道，在正畸科矯正口齒發(fā)育不良的過(guò)程中，機(jī)械應(yīng)力刺激可以促進(jìn)牙周骨組織的重建。適度機(jī)械牽張應(yīng)力刺激對(duì)牙齒的正畸存在積極意義，但是具體的作用機(jī)制尚未明了。Song等[14]通過(guò)構(gòu)建體外機(jī)械牽張應(yīng)力模型，以成纖維細(xì)胞為對(duì)象，探究機(jī)械牽張應(yīng)力對(duì)于口齒矯形的作用，結(jié)果表明，機(jī)械牽張應(yīng)力可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激系統(tǒng)刺激成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡，從而影響正畸效果。所以，本研究利用Flexcell 4000T機(jī)械牽張應(yīng)力儀器構(gòu)建體外牽張應(yīng)力刺激下的細(xì)胞模型，以機(jī)械敏感性離子通道Piezo1為研究的切入點(diǎn)，以Ca2+為第二信使，傳遞機(jī)械信號(hào)，通過(guò)Notch1信號(hào)通路，激活成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)hPDLSC的成骨分化作用。

Piezo1蛋白離子通道是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)械敏感性離子通道，有學(xué)者[15-16]報(bào)道，Piezo1蛋白離子通道與骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞密切相關(guān)，而且可以被陽(yáng)離子非特異性阻滯劑GsMT4所阻斷。另外，通過(guò)冰凍電子顯微鏡解析Piezo1蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Piezo1蛋白是一種7跨膜的三棱錐狀結(jié)構(gòu)，Ca2+可通過(guò)Piezo1蛋白離子通道，從而發(fā)揮作用[17]。本研究中利用Fluo-3 AM探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，利用綠色熒光探針特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的鈣離子，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于siRNA干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明Piezo1蛋白離子通道表達(dá)量增多后，在機(jī)械應(yīng)力刺激下，可以有更多的Ca2+涌入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮第二信使的作用。另外牽張應(yīng)力組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明機(jī)械牽張應(yīng)力刺激可以促進(jìn)Piezo1蛋白的表達(dá)。另外本研究采用RT-PCR檢測(cè)Piezo1 mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果證明機(jī)械應(yīng)力的確可以促進(jìn)Piezo1蛋白的表達(dá)。

RNA干擾技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域常用的一種阻斷基因表達(dá)的方法[18-19]。本研究利用siRNA干擾技術(shù)，構(gòu)建siRNA-Piezo1干擾質(zhì)粒和Piezo1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并且通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染hPDLSC細(xì)胞，利用RTPCR檢測(cè)目的基因Piezo1的表達(dá)。結(jié)果證明，過(guò)表達(dá)組Piezo1 mRNA的表達(dá)水平明顯高于siRNA干擾組（P＜0.05），說(shuō)明過(guò)表達(dá)組的Piezo1表達(dá)量要高于siRNA干擾組。另外，牽張應(yīng)力組Piezo1 mRNA的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明牽張應(yīng)力可以促進(jìn)Piezo1的表達(dá)。成骨基因ALP是成骨細(xì)胞表型最重要的生物標(biāo)志物，是成骨細(xì)胞礦化的標(biāo)志之一[20]。Runx2是骨形成的標(biāo)志蛋白，反應(yīng)了骨細(xì)胞的生物活性[21]。故此本研究采用成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的表達(dá)作為檢測(cè)Piezo1在促進(jìn)PDLSC成骨分化方面的作用。RT-PCR結(jié)果和Western blot結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)組ALP、Runx2、OCN和BSP的mRNA和蛋白表達(dá)水平要明顯高于siRNA干擾組（P＜0.05）。結(jié)果說(shuō)明，過(guò)表達(dá)組hPDLSC的成骨能力高于siRNA干擾組。牽張應(yīng)力組ALP、Runx2、OCN和BSP的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05），結(jié)果說(shuō)明牽張應(yīng)力可以促進(jìn)PDLSC成骨分化。

Notch1信號(hào)通路分子是與干細(xì)胞的分化密切相關(guān)的一類(lèi)分子，邱申彩等[22]的研究表明，Notch1的過(guò)表達(dá)載體可以促進(jìn)hPDLSC的分化和增殖。本研究RT-PCR結(jié)果表明，siRNA-Piezo1可以降低Notch1的表達(dá)，抑制成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的表達(dá)，而Piezo1過(guò)表達(dá)質(zhì)?？梢源龠M(jìn)Notch1的表達(dá)，促進(jìn)成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的表達(dá)。與hPDLSC的成骨分化結(jié)果相結(jié)合，筆者認(rèn)為，機(jī)械牽張應(yīng)力可以促進(jìn)hPDLSC成骨分化的作用是通過(guò)Notch1信號(hào)通路介導(dǎo)。

綜上所述，機(jī)械牽張應(yīng)力可以促進(jìn)Piezo1蛋白的表達(dá)，以Ca2+為第二信使，激活Notch1信號(hào)通路，激活A(yù)LP、Runx2、OCN和BSP的表達(dá)，促進(jìn)hPDLSC成骨分化。而siRNA-Piezo1干擾質(zhì)?？梢宰钄噙@一進(jìn)程，反之，Piezo1的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒可以促進(jìn)PDLSC成骨分化進(jìn)程。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。