張蕾 于旭紅 姚麗萍

煙臺市口腔醫(yī)院，煙臺 264008

齲病是導(dǎo)致牙齒缺失的重要原因，變異鏈球菌為其主要致齲菌。氟離子可通過抑制細(xì)菌生長，促進(jìn)病變組織再礦化，影響微生物代謝活動等方面[1]，達(dá)到齲齒預(yù)防的目的[2]，至今仍是臨床最常用的防齲方法之一。前期部分研究[3]顯示，激光聯(lián)合氟化物可有效提高防齲效果，但攝入過量氟化物存在諸多不良影響的風(fēng)險。而光動力療法（photodynamic therapy，PDT）因其自身的高效殺菌性和不耐藥性，在臨床診療中得到普遍認(rèn)可。為尋找更加高效、安全的齲病預(yù)防方法，本實驗選用Er:YAG激光-氟化鈉聯(lián)合法和亞甲基藍(lán)-光動力療法（methylene blue-photodynamic therapy，MB-PDT）兩種不同的防齲方法，從殺菌率和安全性兩方面進(jìn)行比較。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

變異鏈球菌UA159國際標(biāo)準(zhǔn)菌株（Streptococcus mutans，首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院研究所），半導(dǎo)體激光器（630 nm，F(xiàn)otona公司，斯洛文尼亞），口腔激光治療系統(tǒng)（M021-3AF/3，F(xiàn)otona公司，斯洛文尼亞），激光熒光診斷儀（DIAGNO-dent，Kavo公司，德國），Wistar大鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 選用28只出生后21 d斷奶的同窩別、同鼠齡的Wistar大鼠，于22～24 d喂以含有廣譜抗生素（青霉素和鏈霉素）的蒸餾水；25～27 d在口腔內(nèi)接種變異鏈球菌（每次100 μL，菌液濃度1×108CFU·mL-1），同時喂養(yǎng)致齲飼料Keyes2000#和菌液飲用水；28 d隨機(jī)抽檢變異鏈球菌菌落數(shù)符合致齲要求（＞108CFU·mL-1），停止接種。29 d根據(jù)不同功率密度隨機(jī)分成7組，分別為35 mw·cm-2MB-PDT組（A組）、70 mw·cm-2MB-PDT 組（B組）、35 mw·cm-2Er:YAG激光+2%氟化鈉組（C組）、70 mw·cm-2Er:YAG激光+2%氟化鈉組（D組）、70 mw·cm-2Er:YAG激光組（E組）、2%氟化鈉組（F組）、0.9%生理鹽水組（G組，作為空白對照組），每組4只大鼠，每只取上下頜最后2顆磨牙共8顆，每組樣本32顆。

A、B組在大鼠磨牙咬合面涂布光敏劑亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）孵育5 min后使用半導(dǎo)體激光照射；E組使用Er:YAG激光進(jìn)行照射；F組在牙齒面貼放浸有2%氟化鈉的定量濾紙4 min；C、D組則是Er:YAG激光照射完畢再使用定量濾紙進(jìn)行氟處理。處理前用100 g·L-1水合氯醛麻醉（0.003 mL·g-1）各組大鼠，每周按上述方法處理大鼠1次，連續(xù)處理4周，直至實驗結(jié)束處死大鼠。

1.2.2 細(xì)菌濃度檢測 用消毒棉拭子按同一方向分別擦拭各實驗組大鼠咬合面一圈，放入到5 mL的離心管里，充分振蕩混勻培養(yǎng)液（3 000 r·min-1×2 min），取3 mL于分光光度計下測各組菌懸液在540 nm處光密度（optical density，OD）值。

1.2.3 激光熒光診斷儀（laser-induced fluorescence diagnostic，LF）處理 分組處理前，檢測各組樣本初始LF值。實驗結(jié)束，將各組樣本置于礦液中進(jìn)行脫礦處理12 d后，記錄終末LF值。具體測量方法為：將大鼠磨牙咬合面進(jìn)行十字交叉式劃分，尋找4個測量點，反復(fù)測定3次后取平均值作為該樣本LF值。

1.2.4 牙髓組織病理觀察 樣本分組固定，經(jīng)過脫鈣、包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、封固后，運用光學(xué)顯微鏡觀察牙髓組織，依照Ardian等[4]制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，具體如下。0：牙髓組織無明顯變化；1：部分血管擴(kuò)張、充血，成牙本質(zhì)細(xì)胞層排列紊亂；2：成牙本質(zhì)細(xì)胞層壞死；3：牙髓組織凝固性壞死。

1.2.5 頰黏膜組織病理觀察 切取大鼠頰黏膜組織，經(jīng)過沖洗、固定、脫水、透明、包埋、切片、烘烤、HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，LSD法進(jìn)行兩兩之間的比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同處理方式對變異鏈球菌生長的影響

A～G組的OD值分別為0.25±0.02、0.15±0.01、0.28±0.02、0.17±0.01、0.35±0.02、0.33±0.01、0.63±0.03。與G組相比，A～F組的OD值均有顯著下降，說明細(xì)菌生長受到不同程度的抑制；其中B、D組的OD值降低最顯著，即功率密度為70 mw·cm-2時的抑菌效果最顯著，但2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 LF的檢測結(jié)果

各組LF的檢測結(jié)果見表1。通過LF值反映，各組均有不同程度的脫礦。其中G組LF增加值最大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雖然C、D組增加值最低，但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組LF的檢測結(jié)果Tab 1 Examination results of LF in each group n=32

2.3 牙髓組織病理觀察結(jié)果

通過牙髓組織反應(yīng)評分可見，C、D、E組的評分與其他各組相比明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。各組牙髓的組織病理表現(xiàn)結(jié)果見圖1。F組和G組牙髓組織反應(yīng)為0級表現(xiàn)；A、B、C組偶見1級表現(xiàn)，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張；D組牙髓反應(yīng)有時可達(dá)到2級，局部滲出、細(xì)胞空泡變性，成牙本質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生；E組毛細(xì)血管的擴(kuò)張、充血深達(dá)牙髓深部，伴有炎細(xì)胞浸潤。

2.4 頰黏膜組織病理觀察結(jié)果

各組頰黏膜組織病理觀察結(jié)果見圖2。A、B、G組的大鼠頰黏膜組織病理觀察基本正常；F組中頰黏膜僅可見炎癥細(xì)胞浸潤，其余未見明顯變化；C、D組頰黏膜上皮層呈現(xiàn)不同程度的萎縮、變薄，其他未見顯著改變；E組可見炎癥細(xì)胞聚集，黏膜下層血管減少，固有層有大范圍粉紅色物質(zhì)沉積。

表2 牙髓組織反應(yīng)評分比較Tab 2 Comparisons of pulp tissue response scores

圖1 各組牙髓組織病理觀察 HE × 100Fig 1 Pathological observation of pulp tissue in each group HE × 100

3 討論

齲病是諸多全身疾病的重要誘因。目前的防齲研究工作主要從以下三方面開展：一是破壞致齲菌生物膜，降低致齲能力；二是減少脫礦，促進(jìn)再礦化[5]；三是基因?qū)用嫜芯棵庖叻例x。本實驗選擇比較Er:YAG激光聯(lián)合氟化物和PDT兩種防齲措施，通過對變異鏈球菌生長、代謝的影響，對牙髓、牙周組織的損傷情況，為臨床提供更為高效、安全防齲方法。

PDT利用光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧（active oxygen，ROS），選擇性殺傷細(xì)胞和組織，從而治愈疾病。因其具有作用范圍廣、安全性能高、不易耐受等獨特的優(yōu)勢，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)得到越來越多的關(guān)注[6]，前期體外實驗結(jié)果證明，PDT可顯著抑制變異鏈球菌生長。本實驗選擇MB-PDT進(jìn)行防齲動物實驗，與體外實驗相比，動物模型可更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，提高實驗的準(zhǔn)確性。

氟化物因其具有破壞細(xì)菌代謝，減少產(chǎn)酸[7]，提升抗酸能力[8]，促進(jìn)再礦化等諸多優(yōu)勢，而成為目前臨床應(yīng)用最廣的防齲材料[9]，其中氟化鈉的安全性和有效性已經(jīng)美國食品藥物管理局認(rèn)證。雖然氟化物能在一定程度上預(yù)防齲病產(chǎn)生，但仍有不少研究[10]顯示，如過量攝入氟元素可導(dǎo)致氟牙癥、氟中毒等不良影響。因此，有學(xué)者提出氟化物與激光聯(lián)合應(yīng)用，達(dá)到提升氟利用率，減少使用頻次，從而減少不良反應(yīng)的目的。Er:YAG激光是口腔臨床工作中常用的激光，具有精準(zhǔn)、殺菌、刺激組織愈合生長的能力[11]。因而本實驗選用Er:YAG激光+2%氟化鈉進(jìn)行防齲研究。

圖2 頰黏膜組織病理觀察 HE × 200Fig 2 Histopathological observation of buccal mucosa HE × 200

本實驗結(jié)果顯示：與G組相比，其余各組變異鏈球菌的生長和代謝均受到不同程度的抑制，且B、D組的OD值降低最顯著，證明兩種防齲方法均有良好的殺菌作用。通過LF檢查，C、D組的LF增加值最少，即脫礦最輕，表明Er:YAG激光對氟化鈉可產(chǎn)生協(xié)同作用，其原理可能為：一是激光促進(jìn)氟磷灰石形成[2]；二是促進(jìn)局部氟庫形成[12]；三是激光促進(jìn)氟化物吸收，提升抗酸能力。

牙髓組織遭到外界激惹，可表現(xiàn)為輕微的血液充盈，及時去除刺激，炎癥反應(yīng)可迅速緩解，恢復(fù)正常狀態(tài)[13]。但當(dāng)刺激較強(qiáng)烈或持續(xù)時間較長時，激光熱量可導(dǎo)致牙髓血流減慢，形成血栓，甚至發(fā)生壞死。通過觀察本實驗中牙髓組織病理結(jié)果，A、B組無明顯牙髓組織反應(yīng)，PDT是一種冷光誘導(dǎo)的生物化學(xué)作用，調(diào)整適當(dāng)?shù)哪芰繀?shù)，不會對照射區(qū)組織產(chǎn)生熱損傷；但C、D、E組均出現(xiàn)了不同程度變化，尤其是當(dāng)功率密度增加到70 mw·cm-2時，牙髓免疫炎性反應(yīng)劇烈，表現(xiàn)為深達(dá)牙髓深部的血管擴(kuò)張、充血并伴有炎細(xì)胞浸潤，對牙髓組織傷害性較大。

通過頰黏膜的組織病理觀察，PDT組未見明顯變化，因攜帶正電荷的光敏劑，可穿透細(xì)胞膜迅速進(jìn)入細(xì)胞深層，PDT對病變區(qū)進(jìn)行選擇性殺傷，但不損傷正常組織；由于口腔黏膜在涂布氟化鈉的過程中，會受到氟化鈉的直接刺激引起損害[14]，但由于本實驗使用的氟化鈉濃度較低，且作用時間較短，因而除了部分炎癥細(xì)胞浸潤外，未見到其他明顯的損傷。本研究使用波長為2 940 nm Er:YAG激光，與牙體組織的3 000 nm吸收峰值相近，可有效減少熱損傷，但當(dāng)Er:YAG激光功率達(dá)到一定劑量后，E組仍可見大量的炎癥細(xì)胞，出現(xiàn)黏膜下層血管減少，固有層大范圍粉紅色物質(zhì)沉積。

綜上所述，雖然Er:YAG激光聯(lián)合氟化鈉療法與PDT均有良好的殺菌效果，但PDT對于牙髓、牙周組織刺激較小，炎性反應(yīng)較輕，應(yīng)用安全，且不會發(fā)生氟化物中毒等不良反應(yīng)，因此PDT在齲病預(yù)防中的優(yōu)勢較Er:YAG激光聯(lián)合氟化鈉療法更顯著。今后應(yīng)嚴(yán)格掌握PDT的使用參數(shù)，更好將PDT應(yīng)用于臨床齲病預(yù)防工作中。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。