李加林，張嘉文，丁小麗，林建梭，吳素珍

（1.贛南醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室；2.贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；3.贛南醫(yī)學(xué)院2016級中藥學(xué)專業(yè)本科生；4.贛南醫(yī)學(xué)院2014級生物技術(shù)專業(yè)本科生；5.贛南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 贛州 341000）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種嚴(yán)重的慢性代謝紊亂性疾病，已經(jīng)成為繼心血管疾病和癌癥之后的第三大致死性疾病。糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐漸上升的趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全世界約有3.47 億人患有糖尿病，其中90%～95%的患者為2 型糖尿?。?-3］。到目前為止，很多糖尿病的治療方法并不是十分有效，如口服促胰島素分泌劑和胰島素增敏劑或高劑量的應(yīng)用胰島素會產(chǎn)生不良反應(yīng)，如低血糖、肝臟損傷、乳酸中毒、腹瀉、充血、慢性心臟衰竭和體重增加等。這些藥物雖然能使糖尿病患者的血糖維持在接近正常水平，從一定程度上減輕糖尿病產(chǎn)生的代謝綜合征，但是卻不能達(dá)到根治的目的，糖尿病患者需要終生服藥以控制血糖，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。胰腺移植是治療糖尿病的重要途徑，但供體來源短缺和免疫排斥問題限制了其廣泛應(yīng)用［4-5］。

近年來人們發(fā)現(xiàn)，一些干細(xì)胞和成體細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)分化或轉(zhuǎn)分化為胰島素分泌細(xì)胞。如骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺源性干細(xì)胞、成體干細(xì)胞甚至成體細(xì)胞均可轉(zhuǎn)分化為胰島素分泌細(xì)胞［6-9］，為糖尿病的治療開拓了新的思路，其中最引人注目的是來源于肝臟的細(xì)胞，這是因?yàn)楦闻K和胰腺在發(fā)育上具有同源性，均起源于前腸內(nèi)胚層。但是，當(dāng)前大多數(shù)肝源性細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化還存在一些問題，如體外誘導(dǎo)肝源性細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的比率較低，而細(xì)胞移植后還有致畸致瘤的風(fēng)險，同時還可能產(chǎn)生少量的胰腺外分泌細(xì)胞，還有誘導(dǎo)分化而來的肝源性胰腺細(xì)胞改善糖尿病模型小鼠的高糖癥狀的維持時間有限等，致使細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用也不容樂觀。如果能夠找到一種直接誘導(dǎo)糖尿病患者自身的肝細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞且無毒副作用的藥物，那么就無需在體外經(jīng)過漫長的質(zhì)粒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)分化，再進(jìn)行體內(nèi)移植的過程就能直接在體內(nèi)誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化為胰島β 細(xì)胞，這不僅可以解決糖尿病細(xì)胞治療的細(xì)胞來源問題，而且也不存在細(xì)胞移植后的免疫排斥問題了。

有很多研究表明，中草藥及其有效成分能夠發(fā)揮抗糖尿病作用且毒副作用更?。?0］。油茶（Camellia oleiferaAbel）為常綠小喬木或灌木，是我國特有的木本食用油料樹種，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物，尤其在我國江西省南部分布較多［11］。油茶肉質(zhì)果是由一類外擔(dān)菌（ExobasidiumvexansMassee）侵染油茶后使油茶果膨大、變成空心后引起的，在我國民間可作為野生水果直接食用，僅在每年的清明節(jié)前后，油茶樹梢才會長出這種與油茶果不同的空心肉質(zhì)果（俗稱茶苞）。文獻(xiàn)研究表明油茶肉質(zhì)果提取物能夠明顯的降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖，與傳統(tǒng)中西醫(yī)結(jié)合降血糖藥物消渴丸的降血糖效果相當(dāng)。然而，油茶肉質(zhì)果畢竟是被真菌感染后引起的，而且很多種植者認(rèn)為其會毀壞莊稼，所以即使具有很高的營養(yǎng)價值，人們還是對它有擔(dān)憂。因此，有學(xué)者對油茶肉質(zhì)果的食用安全性進(jìn)行了評價，通過急性毒性試驗(yàn)、小鼠微核試驗(yàn)、小鼠精子致畸實(shí)驗(yàn)，綜合評估得出油茶肉質(zhì)果屬于無毒類物質(zhì)的結(jié)論，可以作為野生水果食用［12］。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)油茶肉質(zhì)果多糖能夠誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝細(xì)胞分泌胰島素，且能使糖尿病小鼠肝臟中轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源盒基因（PDX-1）的蛋白表達(dá)上調(diào)，這將會為開發(fā)利用油茶副產(chǎn)品——油茶肉質(zhì)果提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步拓寬對油茶的開發(fā)和利用奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 油茶肉質(zhì)果的采集油茶肉質(zhì)果于2016 年清明節(jié)前后采集于江西省吉安市，并由贛南醫(yī)學(xué)院李加林副教授鑒定為油茶（Camellia oleiferaAbel）肉質(zhì)果。

1.1.2 油茶肉質(zhì)果多糖的制備將樣品清洗并在65 ℃下干燥，然后切成小塊，再用高速粉碎機(jī)將其磨成細(xì)粉。之后，將粉末通過40 目的篩子，并在4 ℃下儲存直至使用。將研磨后的物料在室溫下浸入蒸餾水中過夜，然后在（99±1）℃下萃取2 h。離心提取物，收集上清液并在70 ℃減壓濃縮。用3 倍體積的乙醇沉淀該溶液，并通過過濾收集沉淀物，并將其重新溶解在蒸餾水中。用Sevage 法去除蛋白質(zhì)后，將多糖溶液用蒸餾水充分透析并冷凍干燥，參考LU 等的研究方法［13］，確定提取物中多糖的含量為40.3%，然后將多糖在－20 ℃下保存用于動物實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級C57BL/6 小鼠，雄性，體重（22±2）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.4 主要試劑STZ購自Sigma公司，鼠抗β-actin一抗（Santa Cruz），兔抗Insulin 一抗（Proteintech），鼠抗Glucagon 一抗（Proteintech），兔抗PDX-1 一 抗（Proteintech），辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG（Santa Cruz），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（武漢博士德），Rhodamine 標(biāo)記的羊抗兔IgG（武漢博士德），DAPI購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病動物模型的建立C57BL/6 小鼠適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)1周后，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周，禁食12 h（禁食不禁水）后連續(xù)5 d腹腔注射100 mg·kg-1STZ（溶于pH4.2～4.5 的檸檬酸鈉緩沖液）。在最后一次注射STZ 后2 周后測隨機(jī)血糖。血糖≥16.7 mmol·L-1的小鼠被認(rèn)為是糖尿病小鼠，并被選為研究對象，正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。隨后將造模成功的小鼠分為糖尿病組（灌胃生理鹽水），油茶肉質(zhì)果多糖組（25 mg 油茶肉質(zhì)果多糖溶解在1 mL生理鹽水中，每10 g體重的小鼠灌胃0.1 mL藥物，即給藥量為250 mg·kg-1油茶肉質(zhì)果多糖），在3個月后，取小鼠肝臟，一部分用中性甲醛固定用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，一部分新鮮肝臟組織凍存于液氮中用于Western Blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光小鼠肝臟組織經(jīng)中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用0.01M PBS 漂洗3 次；2%BSA 37 ℃濕盒內(nèi)封閉30 min；滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體，放在濕盒中，37 ℃孵育30 min，0.01M PBS漂洗3次；加FITC、Rhodamine 標(biāo)記的熒光二抗37 ℃避光孵育30 min，0.01M PBS 避光漂洗3次；DAPI染核，37 ℃孵育5～10 min，PBS 漂洗3 次；抗熒光淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Western Blot采用 SDS-PAGE（SDSpolyacrylamide gel electrophoresis）分離樣品中的蛋白成分。再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到0.45μm硝酸纖維素膜（NC膜）上，NC膜先進(jìn)行封閉，與各自不同濃度的一抗進(jìn)行孵育4 ℃過夜，洗滌后再與過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育，再次洗滌，電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）檢測免疫印跡信號，并使用Bio-Rad Chemi-Doc MP 成像系統(tǒng)記錄蛋白條帶。用Image J軟件分析灰度值。

1.2.4 統(tǒng)計方法用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，多個樣本均數(shù)與對照組樣本均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測肝臟中胰島素的表達(dá)圖1 免疫組化結(jié)果顯示，糖尿病小鼠灌胃250 mg·kg-1油茶肉質(zhì)果多糖3 個月后，在其肝臟某些細(xì)胞的細(xì)胞核周圍顯示棕色（如圖1 中紅色箭頭所示），由此推測油茶肉質(zhì)果多糖可誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝臟細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞。

圖1 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測肝臟中胰島素的表達(dá)

2.2 免疫熒光檢測油茶肉質(zhì)果多糖誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝臟細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞如圖2免疫熒光結(jié)果所示，采用250 mg·kg-1油茶肉質(zhì)果多糖灌胃糖尿病小鼠3 個月后，其肝臟組織細(xì)胞中可見胰島素表達(dá)（紅光），且胰島素均圍繞細(xì)胞核（藍(lán)光）分布，該結(jié)果進(jìn)一步說明油茶肉質(zhì)果多糖可誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝臟細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞，如圖2 中白色箭頭所示。

2.3 油茶肉質(zhì)果多糖誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝臟PDX-1的蛋白表達(dá)水平上調(diào)在肝源性細(xì)胞向胰腺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源盒基因（PDX-1）是關(guān)鍵的調(diào)控基因之一。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)灌胃油茶肉質(zhì)果多糖的糖尿病小鼠其肝臟PDX-1的蛋白表達(dá)水平與糖尿病組比明顯升高，如圖3 所示，這進(jìn)一步說明了油茶肉質(zhì)果多糖可以誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化。

圖2 免疫熒光雙標(biāo)檢測肝臟中胰島素和胰高血糖素的表達(dá)情況

圖3 Western Blot 分析小鼠肝臟中PDX-1的蛋白表達(dá)情況

3 討論

糖尿病時長期伴隨高血糖不僅使糖尿病患者常會發(fā)生全身性的臟器組織損害，還會損傷胰島β細(xì)胞，產(chǎn)生胰島β 細(xì)胞功能障礙從而使胰島素的分泌受損［14-15］。胰島素是體內(nèi)唯一降低血糖的激素，而胰島β 細(xì)胞是唯一負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)、合成和釋放胰島素的細(xì)胞，糖尿病時通常出現(xiàn)胰島β細(xì)胞損傷，從而影響胰島素的分泌和血糖控制［16-17］。因此，長期以來人們一直致力于增加胰島β 細(xì)胞數(shù)量，修復(fù)胰島β細(xì)胞功能來治療糖尿病，但是能夠分裂的β 細(xì)胞比例極少（僅占1%），因此僅通過刺激現(xiàn)有的胰島β細(xì)胞分裂來增加胰島素的分泌似乎也不太可能。近年來人們發(fā)現(xiàn)，一些干細(xì)胞和成體細(xì)胞在體外可被誘導(dǎo)分化或轉(zhuǎn)分化為胰島素分泌細(xì)胞，為糖尿病的治療開拓了新的思路。

通過免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，油茶肉質(zhì)果多糖能夠誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝細(xì)胞生產(chǎn)胰島素。在肝源性細(xì)胞向胰腺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子胰十二指腸同源盒基因（PDX-1）是關(guān)鍵的調(diào)控基因之一［18］。有研究表明，通過導(dǎo)入PDX-1 基因，能夠使成熟的肝細(xì)胞或具有分化潛能的胎肝細(xì)胞分化成胰腺細(xì)胞，有學(xué)者通過克隆人、小鼠、大鼠的PDX-1 基因編碼區(qū)序列，構(gòu)建PDX-1 真核細(xì)胞表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染小鼠胎肝基質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)向具有胰腺功能的細(xì)胞分化，這提示PDX-1基因在胰腺組織發(fā)育過程中具有非常重要的作用。進(jìn)一步的研究表明，油茶肉質(zhì)果多糖可以誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝臟中PDX-1 的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，這可能是油茶肉質(zhì)果多糖誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原因。

據(jù)文獻(xiàn)報道，我國產(chǎn)生肉質(zhì)果的油茶樹為25%～50%，最高可達(dá)60%～70%［19-21］。然而，由于不了解其營養(yǎng)價值和藥用價值，致使這種可食用的資源沒有列入野生果的行列，更沒有得到開發(fā)和利用，在我國大部分地區(qū)，每年清明節(jié)后這種果實(shí)便自然脫落，“無人問津”。本實(shí)驗(yàn)為合理開發(fā)利用油茶副產(chǎn)品——油茶肉質(zhì)果提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，開拓了新思路，將為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展帶來曙光。但本實(shí)驗(yàn)所提取的油茶肉質(zhì)果多糖為粗提物，成分較復(fù)雜，在后期的實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)一步探討油茶肉質(zhì)果粗多糖中發(fā)揮作用的具體成分。