徐 東,朱鈺方,鄭元義,羅 宇,陳航榕

(1. 上海理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200093; 2. 中國(guó)科學(xué)院 上海硅酸鹽研究所,上海 200050; 3. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院 上海超聲醫(yī)學(xué)研究所,上海 200233; 4. 同濟(jì)大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200092)

骨肉瘤是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,起源于骨,主要發(fā)生在兒童和青少年時(shí)期。它常在股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端發(fā)芽,并容易轉(zhuǎn)移到肺。目前臨床上對(duì)骨肉瘤的治療主要采取手術(shù)切除或者截肢方式[1]。手術(shù)切除雖然可以去除腫瘤病灶,但是難清除由于骨肉瘤浸潤(rùn)生長(zhǎng)殘留的腫瘤細(xì)胞,往往術(shù)后一定時(shí)間復(fù)發(fā)[2]。此外,截肢雖然在某種程度上更為徹底清除原發(fā)病灶,但是由于骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移性,在截肢前腫瘤已轉(zhuǎn)移到其他臟器,截肢意義不大,同時(shí)截肢后病人往往失去勞動(dòng)能力,給病人后期回歸生活造成了巨大障礙[3]?，F(xiàn)今,雖然可以采用保守的化學(xué)治療,但是其全身性毒副作用以及較低的抗腫瘤效率也難以滿足治愈骨肉瘤的需求。由此可見(jiàn),研發(fā)一種更為安全高效的骨肉瘤治療藥物或者技術(shù)迫在眉睫。

熱療作為一種新型的高效治療技術(shù)正在被越來(lái)越多的科研人員所關(guān)注,主要分為光熱治療和磁熱治療[4]。光熱治療受限于激光的穿透深度,且存在光熱性能衰減的問(wèn)題[5],限制了其在臨床上的應(yīng)用。磁熱治療因其無(wú)穿透深度限制、非侵入性等特點(diǎn)[6-8],在腫瘤的深部治療方面具有獨(dú)特的作用。前期的研究,幾乎都采用過(guò)高溫(＞50 ℃)的磁熱消融方式殺死腫瘤細(xì)胞[9-10],然而過(guò)高溫度會(huì)對(duì)瘤周正常組織產(chǎn)生熱輻射,從而破壞正常組織使其喪失生物學(xué)功能。因此,如何實(shí)現(xiàn)在較低磁熱溫度(正常組織細(xì)胞能耐受的溫度約為43 ℃)下高效殺死腫瘤細(xì)胞成為急需解決的問(wèn)題[11]。據(jù)報(bào)道利用低熱可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性凋亡,但是,由于腫瘤細(xì)胞在低于45 ℃刺激下會(huì)誘發(fā)應(yīng)急反應(yīng)產(chǎn)生大量的熱休克蛋白(HSP90)抑制細(xì)胞凋亡,削弱低熱對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力,療效并不理想[12-14]。

圍繞骨肉瘤的低溫、高效磁熱治療這一研究目標(biāo),借鑒臨床治療脊柱壓縮性骨折時(shí)可注射骨水泥液固相變?cè)韀15],我們研發(fā)了一種可注射的液固相變磁熱材料,通過(guò)微創(chuàng)的方式將材料注入腫瘤組織,液態(tài)材料在接觸腫瘤之后迅速轉(zhuǎn)化為固態(tài)磁性復(fù)合材料。在外加脈沖磁場(chǎng)刺激下,局部產(chǎn)生熱殺死腫瘤細(xì)胞。此外,利用表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)抑制腫瘤細(xì)胞在低溫刺激下產(chǎn)生大量的熱休克蛋白(HSP90)的活性,有效提高了低溫磁熱下對(duì)骨腫瘤細(xì)胞的殺傷力,避免了高溫對(duì)瘤周正常組織的熱輻射損傷。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 Fe3O4@PEI的制備

將FeCl3·6H2O的水溶液(1.3 g,20 mL)放入200 mL的三頸燒瓶中,通入高純氮?dú)?0 min以上去除水中溶解氧,在氮?dú)夥諊鲁掷m(xù)攪拌15 min。將Na2SO3水溶液(0.2 g,10 mL)滴加到上述溶液中,在氮?dú)夥諊鲁掷m(xù)攪拌30 min后,將超支化的聚乙烯亞胺(PEI.NH2) (0.5 g,5 mL)和氨水(2 mL)依次加入上述混合物溶液中。撤去氮?dú)獗Ｗo(hù),將混合物溶液在60～70 ℃下攪拌30 min,冷卻至室溫后繼續(xù)攪拌1.5 h,采用磁分離方式收集、洗滌黑色產(chǎn)物Fe3O4@PEI納米顆粒,重復(fù)洗滌三次以上。最后,將Fe3O4@PEI分散在超純水中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PLGA/Fe3O4及PLGA/Fe3O4/EGCG的制備

首先稱量聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)(1 g)溶于1 mL N-甲基吡咯烷酮(NMP),然后放入37 ℃的干燥箱中過(guò)夜。采用磁分離方式用二甲亞砜(DMSO)洗滌Fe3O4@PEI納米顆粒,最后將含F(xiàn)e 100 mg 的納米顆粒分散在2 mL的DMSO中,并通過(guò)磁力攪拌方式將其分散到的PLGA溶液中形成PLGA/Fe3O4的共混液。然后將小分子抑制劑EGCG分散在PLGA/Fe3O4混合溶液中形成PLGA/Fe3O4/EGCG的混合溶液,PLGA/Fe3O4(PF),PLGA/Fe3O4/EGCG(PFE)復(fù)合材料可在水溶液中液固相變之后得到。

1.3 磁熱性能測(cè)試

將不同F(xiàn)e濃度(0.45、0.9、1.8、3.6 mg/mL)的溶液1.5 mL置于2 mL離心管中,將其放在交變電流頻率為550 kHz,輸出功率恒定為7 kWh、線圈大小為10 cm的磁場(chǎng)下,利用Fotric-225熱紅外相機(jī)監(jiān)測(cè)材料的升溫曲線。

1.4 r2弛豫率測(cè)試及T2加權(quán)磁共振(MR)成像

用0.5%瓊脂糖溶液稀釋Fe3O4溶液配置一系列Fe濃度梯度(0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 mmol/L)樣品,冷卻至室溫后,測(cè)不同F(xiàn)e濃度樣品的T2弛豫時(shí)間,計(jì)算出r2弛豫率[16]。

用臨床使用的3.0 T磁共振成像儀評(píng)估上述樣品T2加權(quán)MR成像性能(TR=4313.7,TE=99.6)。另外將PLGA/Fe3O4配制成不同F(xiàn)e濃度的溶液,分別取50 μL注射到去離子水中使其液固相變,考察液固相變之后的復(fù)合材料在3.0 T磁共振成像儀中T2加權(quán)MR成像[17]。

1.5 細(xì)胞毒性測(cè)試

將一定體積的PLGA、PF、PFE注射到2 mL超純水中,得到PLGA相變體及PF、PFE復(fù)合材料,將得到的三組材料放置水中過(guò)夜以充分排盡NMP。將材料轉(zhuǎn)移至完全培養(yǎng)基中使材料的質(zhì)量濃度為0.1 g/mL,浸泡24 h后棄去材料,將浸提液用新鮮培養(yǎng)基稀釋成不同濃度(不同百分含量的浸提液)。將骨肉瘤MG-63細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植在96孔板中,貼壁過(guò)夜,然后將稀釋后的復(fù)合材料浸提液100 μL與細(xì)胞在37 ℃、5vol% CO2的環(huán)境下共培養(yǎng)24 h,棄掉培養(yǎng)基,90 μL無(wú)血清培養(yǎng)基+10 μL細(xì)胞活力檢測(cè)試劑CCK-8共培養(yǎng)2～4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定430 nm波長(zhǎng)吸收值。

1.6 體外細(xì)胞低熱治療

將骨肉瘤MG-63細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/孔密度種植在24孔板中,在37 ℃、5vol% CO2的濕潤(rùn)氣氛中貼壁培養(yǎng)24 h。分別加入50 μL PLAG、PF、PFE液體形成的PLGA相變體及PF、PFE復(fù)合材料分別共培養(yǎng)12 h后,利用電流頻率為550 kHz,輸出功率恒定為7 kW,線圈大小為10 cm的磁場(chǎng)升溫(SPG400KZ高頻感應(yīng)加熱器),利用熱紅外相機(jī)將監(jiān)測(cè)溫度控制在43 ℃ 40 min,棄掉三組材料再培養(yǎng)24 h后,再棄掉培養(yǎng)基,90 μL無(wú)血清培養(yǎng)基+10 μL CCK-8試劑共培養(yǎng)2～4 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定430 nm波長(zhǎng)吸收值。

2 結(jié)果與討論

圖1 超順磁性Fe3O4納米顆粒的透射電鏡照片(a)、X射線衍射圖譜(b)、X射線光電子圖譜(c)、r2弛豫率(d)、飽和磁化強(qiáng)度(e)以及在交變磁場(chǎng)中不同F(xiàn)e濃度的升溫曲線(f)Fig. 1 TEM images of superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles (a),XRD patterns (b),XPS spectra (c),r2 relaxation rate (d),saturation magnetization (e),and temperature rise curves of different Fe concentrations in an alternating magnetic field (f)

采用溫和還原法[17-19]合成了超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPION),如圖1(a)所示,制備得到的納米顆粒呈準(zhǔn)球形,直徑約為15 nm。XRD分析顯示納米顆粒晶體結(jié)構(gòu)的三強(qiáng)峰(2θ=35.422°、56.942°、62.515°)與標(biāo)準(zhǔn)卡片PDF#75-003較好對(duì)應(yīng),表明合成樣品物相組成為Fe3O4(圖1(b))。為了驗(yàn)證樣品中Fe2+與Fe3+的相對(duì)比值,采用X射線光電子能譜(XPS)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試,從圖1(c)可看到兩個(gè)明顯的Fe2P3/2(709.78 eV)和Fe2P1/2(722.88 eV)特征峰,經(jīng)過(guò)擬合計(jì)算得到樣品中的Fe2+:Fe3+= 33.2 :66.8 ≈1 :2,進(jìn)一步證實(shí)了制備得到的氧化鐵納米顆粒為Fe3O4。磁性能測(cè)試表明所合成的氧化鐵納米顆粒飽和磁化強(qiáng)度為8.96×104A·m-1(圖1(e)),與文獻(xiàn)報(bào)道的超順磁性Fe3O4飽和磁化強(qiáng)度基本一致[20],表明制備得到納米顆粒具有潛在的MR成像性能。弛豫率是衡量納米顆粒MR成像性能的重要指標(biāo)之一,通過(guò)測(cè)定材料的馳豫時(shí)間,經(jīng)擬合后計(jì)算得到Fe3O4的r2值為143.69 mmol·L-1·s-1(如圖1(d)),表明制備得到的納米顆粒具有較高的T2加權(quán)MR成像性能。隨后在交變磁場(chǎng)頻率為550 kHz、輸出功率恒定為 7 kW、線圈大小為10 cm的條件下[21]測(cè)定制備得到的磁性氧化鐵納米顆粒的磁熱升溫曲線如圖1(f)所示,隨著Fe濃度的升高,納米顆粒升溫能力逐漸增強(qiáng),呈濃度依賴性。當(dāng)Fe濃度為3.6 mg/mL時(shí),5 min內(nèi)材料溫度增加26.3 ℃,可滿足體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)磁熱升溫需求。

如圖2(a,b)所示裝載有Fe3O4納米粒子的PLGA/Fe3O4復(fù)合物(PF)在未與水相接觸之前,呈可注射的粘稠流動(dòng)液體,可用1 mL注射器吸取,為其體內(nèi)腫瘤磁熱治療提供了可能。將流動(dòng)的PF注入水中后,可快速發(fā)生液固相變形成PF復(fù)合材料(如圖2(c)所示),表明在進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射后,PF可以錨定在腫瘤部位,發(fā)揮被動(dòng)靶向功能。

圖2 Fe3O4分散到PLGA液體中得到均勻流體的數(shù)碼照片(a),用1 mL注射器吸取PLGA/ Fe3O4流體數(shù)碼照片(b),用注射器將PLGA/Fe3O4流體打入水中液固相變數(shù)碼照片(c)Fig. 2 Digital photo of Fe3O4 dispersed in PLGA liquid to obtain a homogeneous fluid (a); Digital photo of PLGA / Fe3O4 fluid sucked with a 1 mL syringe (b); Digital photo of liquid-solid phase transition of PLGA / Fe3O4 fluid driven into water with a syringe (c)

通過(guò)掃描電鏡對(duì)PF復(fù)合物在發(fā)生液固相變之后所形成的PF復(fù)合材料表面形貌進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示在液固相變之后形成的復(fù)合材料具有多孔表面且粗糙褶皺的結(jié)構(gòu)(如圖3(a)所示),這樣的結(jié)構(gòu)有利于小分子藥物的釋放,為后續(xù)HSP90小分子抑制劑的裝載提供了可能。此外,通過(guò)能量色散X射線光譜(EDX)測(cè)試發(fā)現(xiàn)有Fe元素存在,并且分散均勻,表明Fe3O4成功地均勻分散到PLGA流體中(圖3(b,c))。

圖3 PLGA/Fe3O4(PF)復(fù)合材料的SEM照片(a)及其對(duì)應(yīng)能量色散X射線光譜(b),以及不同元素分布掃描(c)Fig. 3 SEM image of PLGA/Fe3O4 (PF) composite (a),with its corresponding EDX spectrum (b),and different elements mapping (c)

為了控制復(fù)合材料的磁熱升溫幅度,對(duì)材料體系的體積/含鐵量進(jìn)行了優(yōu)化,最終確定比例為注射體積50 μL、Fe含量為10%。對(duì)優(yōu)化后的PF復(fù)合材料在不同介質(zhì)(空氣和水)中磁熱升溫性能進(jìn)行了研究。如圖4(a)所示,50 μL、Fe含量為10%的PF在交變磁場(chǎng)作用下,5 min內(nèi)在水中和空氣中溫度上升量分別為11 ℃和21.3 ℃,滿足體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需求。不同鐵含量PF復(fù)合材料的T2加權(quán)MR成像性能表征結(jié)果顯示(圖4(b))隨著Fe濃度的增加,PF復(fù)合材料的MR信號(hào)逐漸衰減,呈現(xiàn)濃度依賴性,表明PF具有良好的T2加權(quán)MR成像潛能[22]。采用浸提液共培養(yǎng)方法評(píng)估了PF復(fù)合材料的細(xì)胞毒性(圖4(c)),結(jié)果顯示當(dāng)復(fù)合材料在培養(yǎng)基中濃度為0～80 mg/mL范圍內(nèi)時(shí),骨肉瘤MG-63細(xì)胞存活率均保持在90%以上(圖4(c)),表明體外細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)所用PF復(fù)合材料(50 μL,液固相變之后濃度為59.45 mg/mL)具有良好的細(xì)胞相容性。評(píng)估HSP90小分子抑制劑EGCG的細(xì)胞相容性,以支撐后續(xù)的體外細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)。采用培養(yǎng)箱升溫模擬磁熱升溫[23],研究發(fā)現(xiàn)43 ℃低溫處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞40 min后,骨肉瘤MG-63細(xì)胞的存活率隨小分子抑制劑EGCE濃度增加而顯著降低,當(dāng)EGCE濃度為200 μg/mL時(shí),37 ℃正常培養(yǎng)組骨肉瘤MG-63細(xì)胞存活率為84%,而低熱43 ℃治療組的細(xì)胞存活率僅有24%,結(jié)果證實(shí)小分子抑制劑能有效地抑制了熱休克蛋白(HSP90)活性,削弱了HSP90對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的保護(hù)作用實(shí)現(xiàn)了在低溫下殺死骨肉瘤的研究目的(圖4(d))。

圖4 PLGA/Fe3O4復(fù)合物(PF)在交變磁場(chǎng)中的升溫(a)、細(xì)胞毒性(b)及體外T2加權(quán)MR成像(c),以及在模擬磁熱升溫(43 ℃)下抑制劑EGCG的細(xì)胞相容性(d)Fig. 4 Temperature rise of PLGA/Fe3O4 composite (PF) in AMF (a),cytotoxicity (b) and in vitro T2-weighted MR imaging (c),and the cytocompatibility of the inhibitor EGCG under simulated magnetocalormic temperature rise (43 ℃,d)

為了評(píng)估PFE復(fù)合材料對(duì)骨肉瘤的治療效果,將PLGA、PF、PFE三組材料與骨肉瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的24孔細(xì)胞板置于電流頻率為550 kHz、輸出功率恒定為7 kW、線圈大小為10 cm的磁場(chǎng)中,通過(guò)控制交變磁場(chǎng)的工作時(shí)間,利用紅外相機(jī)監(jiān)控溫度。在AMF下(圖5),對(duì)照組與PLGA組都未升溫,且骨肉瘤細(xì)胞MG-63的存活率都在95%以上,表明磁場(chǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)損傷作用。而PF、PFE復(fù)合材料組都可在AFM下升溫。利用熱紅外相機(jī)監(jiān)測(cè)并控制溫度在43 ℃,保持40 min,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PF組低溫磁熱處理前后骨肉瘤細(xì)胞都具有高于80%的存活率,這是由于熱休克蛋白HSP90在低熱刺激下的大量表達(dá)啟動(dòng)熱應(yīng)激保護(hù)[24],造成低熱(43 ℃)下不能有效殺死腫瘤細(xì)胞。值得注意的是,PFE組低溫磁熱處理后骨肉瘤細(xì)胞31%的存活率大大低于未低溫磁熱處理81%的存活率,表明HSP90小分子抑制劑ECGG可以有效地抑制HSP90的活性,使得骨肉瘤細(xì)胞在較低的溫度下就能被高效殺死,從而有望實(shí)現(xiàn)在低溫下治療腫瘤的目的,為后續(xù)的動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)提供支撐。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)簡(jiǎn)易方法制備出基于PLGA液固相變的可注射磁性材料。其中超順磁性氧化鐵納米顆粒Fe3O4實(shí)現(xiàn)腫瘤T2加權(quán)MR成像的同時(shí)在交變磁場(chǎng)激發(fā)下可以發(fā)生磁熱轉(zhuǎn)化,從而實(shí)施腫瘤的磁熱治療。此外,利用小分子抑制劑有效抑制熱休克蛋白HSP90活性,削弱腫瘤細(xì)胞的熱應(yīng)激保護(hù)機(jī)制,可實(shí)現(xiàn)低溫(43 ℃)磁熱殺死骨肉瘤細(xì)胞,有望克服高溫磁熱對(duì)瘤周正常組織存在熱輻射損傷的不足,為深部腫瘤的磁熱治療提供新的方法和材料支撐。