劉爾黎，鐘雯怡，劉增一，楊 琨，劉 琪

(遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

2型糖尿病與多種疾病有密切關系，牙周炎現已被普遍認為是2型糖尿病的并發(fā)癥之一，已被學者確認為糖尿病的第六大并發(fā)癥[1]。牙周炎是牙齒周圍組織的慢性炎癥，而目前研究許多的關注點都在于牙齦的退縮、牙槽骨的吸收以及牙齒的松動脫落[2]。但是患者可存在牙齒冷熱刺激敏感的癥狀，很大程度上取決于牙根面的牙骨質破壞以及再生修復能力的降低。2型糖尿病作為全身因素可促進牙周炎的發(fā)展，通常其嚴重程度與血糖水平呈正相關關系[3]，并且牙周炎的治療有利于糖尿病患者血糖值以及糖化血紅蛋白的控制，而治療糖尿病也有利于牙周炎各項指標的恢復[4]，因此，對糖尿病伴牙周炎造成的更為嚴重的牙周炎癥狀機理的研究，有利于此類患者疾病病理狀態(tài)的合理解釋、治療以及預后效果的評估。

牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)來源于牙根周圍的韌帶組織牙周膜，因其具有分化成為成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質細胞的能力，在牙周組織再生中可能扮演重要角色[5]，自Seo等[6]成功把牙周膜干細胞從牙周膜中分離出來，對其相關研究目前仍在不斷深入，Gay 等[7]體外實驗結果表明，PDLSCs具有較強的克隆形成能力。

目前有學者研究表明，來源于牙周膜的間充質干細胞可以誘導分化為成牙骨質細胞[5,8-9]，成牙骨質細胞是牙骨質形成的重要功能細胞，在牙根形成、牙骨質修復中起著關鍵性作用。我們的研究團隊前期研究結果顯示，2型糖尿病伴牙周炎的牙周膜干細胞骨向分化能力降低[10]，但PDLSCs的成牙骨質分化能力是否發(fā)生改變目前還不甚清楚。為此，本研究擬對2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干細胞的成牙骨質分化能力進行探索，為解釋2型糖尿病伴牙周炎狀態(tài)下，牙周組織再生修復能力降低，牙骨質破壞所導致的牙本質暴露，患者冷熱刺激敏感的可能原因提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 胎牛血清FBS(四季青公司)；胰蛋白酶、α-MEM培養(yǎng)基、膠原酶、(Gibco 公司)；鼠抗人 CD29、CD44、CD45、stro-1、CD90、CD271、CD166單克隆抗體(Abcam公司)；CCK-8(日本Dojindo Kagaku 公司)；BD流式細胞儀、濕度CO2細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、細胞總RNA提取試劑盒(生工生物公司)；cNCPs英國伯明翰大學的Smith教授提供，Real Time-PCR儀、凝膠成像分析儀、分光光度計、PCR逆轉錄儀、Western blot相關試劑、ALP定量試劑盒(南京建成)。

1.2 方法

1.2.1 取材標準及實驗分組 健康組(H-PDLSCs)牙周膜組織獲取主要對象為在遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院就診，18～25歲需拔出前磨牙或第三磨牙患者(因正畸或智齒異位萌出)。入選患者的標準為不吸煙，無糖尿病病史及家族史，血糖水平正常、口內余留牙不少于20顆；無系統疾病或感染。2型糖尿病伴牙周炎組(DP-PDLSCs):就診于遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院的2型糖尿病伴重度牙周炎癥病患，平均年齡為30～45歲入選標準:患者被診斷為2型糖尿病，病程為1年及以上，未有其他嚴重全身疾病及并發(fā)癥;用藥量近期未見明顯變化，無吸煙史。并符合以下條件:①口內殘留牙數不少于15顆，因重度牙周炎需拔除的患牙，無明顯齲壞、牙髓及根尖周病;②X線片上牙槽骨的損失情況超過根長1/2者，半年內應無牙周病治療史。組織塊與單克隆分離培養(yǎng)法：收集到的牙周膜組織PBS緩沖液沖洗3次，收集沖洗液，800 rpm離心3 mim，1%Ⅰ型膠原酶消化，培養(yǎng)基中和離心，組織均勻平鋪于10 cm細胞培養(yǎng)皿，加入預配制濃度為100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液約4～5 mL全覆蓋碎屑組織，置于37 ℃含5%CO2的恒溫箱中貼壁培養(yǎng)觀察到4 h后見細胞貼壁形態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)20 h換液，于細胞匯聚率為90%～100%時進行常規(guī)消化傳代，稀釋為1/200 μL的PDLSCs細胞，接種于96孔板，24 h換液，待單克隆細胞長滿孔板底部后消化傳代即為第3代PDLSCs。

1.2.2 流式細胞儀檢測相關表面分子 取生長狀態(tài)良好的第3代PDLSCs，常規(guī)消化離心后，稀釋并計數，細胞數量為5×105個/1.5 mL EP管，加入已配制好的含3%胎牛血清PBS重懸細胞，加入CD45、CD90、CD44、CD29、CD166 2 μL，4 ℃冰箱避光孵育12 h(過夜)，12 000 r/min 離心5 min，加入單抗相對應的熒光二抗避光孵育2 h，無需熒光的加入等量PBS。加入含3%胎牛血清的PBS混合均勻溶液，吹勻，3% 胎牛血清PBS清洗，12 000 r/min離心5 min，清洗2～3次后加300 μL 3%胎牛血清 PBS，重懸，流式細胞儀檢測各組細胞表面分子。實驗重復次數3次。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 利用CCK-8試劑盒對比兩組細胞7 d增殖能力，利用第3代生長增殖狀態(tài)良好的H-PDLSCs及DP-PDLSCs兩組細胞，EDTA+胰蛋白酶消化離心，均勻稀釋并上機細胞計數，細胞密度為1×103/孔接種至96孔板，分別在每日正午12時測7 d增殖曲線，每孔細胞培養(yǎng)基加入預配制200 μL 10%胎牛血清 DMEM-F12。各組細胞加入10 μL CCK-8，置于37 ℃含5%CO2的恒溫箱4 h，上酶標儀檢測450 nm吸光度值，繪制7d H-PDLSCs及DP-PDLSCs連續(xù)生長曲線。實驗重復次數3次。

1.2.4 RT-PCR檢測 ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA表達取培養(yǎng)至規(guī)定時間狀態(tài)良好的兩組細胞，用10 μg/mL cNCPs[11]和礦化誘導培養(yǎng)基(成牙骨質培養(yǎng)基)處理，培養(yǎng)7 d。各組細胞RT-PCR檢測相關基因。本實驗重復次數3次。按TRIzol說明書方法提取EMSCs總RNA，并用反轉錄試劑盒合成cDNA。參照GenBank數據庫，基因號分別為：ALP(ID:249)、OPN(ID:6696)、OCN(ID:43567)、CEMP1(ID:752014)、CAP(ID:36084)，以Primer primer 5.0計算機軟件設計引物；以GAPDH為內參照，采用Real Time-PCR檢測，反應體系為：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各0.5 μL、樣本模板2 μL；反應條件:95 ℃ 5 min、 94℃ 30 s 、65℃ 30 s、 40個循環(huán)。實驗重復3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列見表1。

1.2.5 Western blot檢測蛋白GAPDH、OCN、CEMP1、CAP的表達 取14d后牙周膜干細胞用10 μg/mL cNCPs成牙骨質誘導[11]和礦化誘導培養(yǎng)基處理后H-PDLSCs及DP-PDLSCs兩組細胞進行總蛋白提取，BCA法進行蛋白定量測定，電泳，轉膜，封閉，免疫反應，以GAPDH內參蛋白對相關蛋白OCN、CEMP1、CAP進行顯影檢測蛋白表達。本實驗重復次數3次。

表1 引物基因序列

1.2.6 ALP活性和礦化結節(jié)形成量分析 常規(guī)消化處理增殖良好的兩組細胞，10 μg/mL cNCPs成牙骨質誘導培養(yǎng)14d后，取兩組細胞分別用ALP試劑盒(AKP/ALP)對各組細胞進行染色。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測 PDLSCs 表面標志物 本實驗通過組織塊法與單克隆法成功分離并培養(yǎng)擴增出健康來源牙周膜干細胞與2型糖尿病伴牙周炎來源的牙周膜干細胞，流式細胞儀檢測PDLSCs 表面標志物 CD45、CD90、CD44、CD29、CD166其檢出率分別為0.02%、99.94%、99.59%、100.00%、99.99%，證明本細胞提取方法獲得的細胞都為間充質來源(見圖1)。

圖1 流式細胞儀檢測PDLSCs 各表面標志物的檢出率

2.2 CCK-8檢測兩組細胞增殖 在連續(xù)7 d相同條件培養(yǎng)情況下，CCK-8檢測兩組細胞增殖情況，H-PDLSCs增殖能力高于DP-PDLSCs，兩組用獨立樣本T檢驗檢測差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 CCK-8檢測兩組細胞增殖情況比較

2.3 RT-PCR檢測DP-PDLSCs中各組基因表達量比較 兩組細胞成牙骨質誘導7 d后RT-PCR結果表明DP-PDLSCs ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA的表達量，DP-PDLSCs中各組基因表達量較H-PDLSCs低(見圖3)。

*：與DP-PDLSCs比較，P<0.05。圖3 RT-PCR檢測DP-PDLSCs中各組基因表達量

2.4 Western blot檢測各組蛋白的表達 成牙骨質誘導14 d后OCN、CEMP1和CAP蛋白表達，OCN、CEMP1、CAP蛋白表達量DP-HPDLSCs較H-PDLSCs低(見圖4)。

圖4 Western blot檢測各組蛋白的表達

2.5 ALP活性和礦化結節(jié)形成量分析 常規(guī)消化處理增殖良好的兩組細胞，成牙骨質誘導培養(yǎng)14 d后，H-PDLSCs成牙骨質礦化能力高于DP-PDLSCs成牙骨質礦化能力。

A:H-PDLSCs;B:DP-PDLSCs。圖5 ALP分析兩組細胞的活性和礦化結節(jié)形成量

3 討論

目前，已經有很多研究證實，慢性牙周炎作為2型糖尿病的第六大并發(fā)癥[11]，并且糖尿病患者牙周炎患病的風險是健康者的2～3倍[12]，嚴重的影響到中老年患者的生活質量。因此，對糖尿病及牙周炎相互影響的發(fā)生、發(fā)展過程仍是牙周醫(yī)學研究的熱門話題。

PDLSCs作為牙周組織再生的重要細胞之一，在牙周組織內的核心作用主要是是通過干細胞克隆增殖以及分化來形成不同數量以及不同種類的牙周組織。本實驗我們選取了CD45、CD90、CD44、CD29、CD166細胞表面標記物進行檢測，其結果顯示牙周膜干細胞具備間充質來源的特點，并且存在良好的干細胞干性以及優(yōu)良的增殖能力。值得一提的是，本實驗結果發(fā)現，2型糖尿病伴牙周炎患者牙周組織來源的牙周膜干細胞的增殖及分化能力降低。而牙周膜干細胞是一種獨特的間充質干細胞，能夠分化為多種牙周組織包括：牙周膜、牙骨質、牙槽骨等。牙骨質是特殊的無血管礦化組織，類似骨樣組織，牙骨質基質由成牙骨質細胞分泌而形成，是牙周組織再生的關鍵[13]。 并且最近相關研究發(fā)現，牙周膜干細胞能夠分化成為成牙骨質細胞[5,8-9]，成牙骨質細胞是牙周組織中牙骨質形成的重要功能細胞，在牙根形成、牙周病牙骨質修復及牙根吸收與修復過程中起著關鍵性作用。牙根表面修復性牙骨質的形成，成牙骨質細胞附著的干預，最終起到防止牙根吸收的目的。成牙骨質細胞分泌的牙骨質基質礦化起著決定作用，所以成牙骨質細胞是牙骨質修復和再生的基礎。成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質細胞均可由牙周膜干細胞分化而成，生成牙骨質基質的唯一組織細胞是成牙骨質細胞，其與牙槽骨內的成骨細胞來源于同一前體細胞，位于牙周膜內側[14]。因此，2型糖尿病伴牙周炎患者牙周組織來源的牙周膜干細胞的增殖及分化能力降低進一步表明了此類疾病患者牙周組織再生能力的減弱，病態(tài)細胞的各種能力降低也是由于糖尿病及牙周炎兩種疾病狀態(tài)的疊加所導致。

牙骨質附著蛋白(Cementum attachment protein，CAP)表達于牙骨質與成牙骨質細胞中[15]，牙槽骨中未見陽性反應[16]，CAP被認為可以作為成牙骨質細胞特異性標志分子。因此本實驗選定CAP蛋白作為檢驗成牙骨質方向分化的指標之一。堿性磷酸酶(ALP) 是有骨化潛能的細胞標志性酶之一，它在細胞體外鈣化起關鍵作用。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是間充質干細胞重要的礦化相關基因之一，在上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath，HERS)的發(fā)育中就已經存在，并且在牙骨質礦化過程中調節(jié)晶核的生長和礦化速度[17]。骨鈣素(Osteocalcin，OCN )是反映成骨細胞分化成熟的指標，能準確反映成骨細胞的成骨功能，研究表明牙根面靠近牙周膜區(qū)域的牙骨質內有高濃度的OCN表達[18]，能夠作為細胞礦化的關鍵因子促進牙骨質再生。牙骨質蛋白1(Cementum protein 1,CEMP1)是一種新的牙骨質成分，其存在僅限于成牙骨質細胞及其祖細胞-牙周膜干細胞中也高度表達，牙周膜干細胞CEMP1的過表達增強了成牙骨質分化和牙周及成骨細胞表型的減弱，表明CEMP1緊密參與了牙骨質的再生及形成[19]。

本實驗以ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP為指標對2型糖尿病伴牙周炎來源的人牙周膜干細胞成牙骨質礦化功能的變化對比。通過RT-PCR結果表明DP-PDLSCs： ALP、OPN、OCN、CEMP1、CAP mRNA的表達量均低于H-PDLSCs；Western blot檢測結果趨勢與RT-PCR結果相一致，成牙骨質誘導14d OCN、CEMP1、CAP蛋白表達量DP-HPDLSCs較低。ALP試劑盒染色結果顯示，DP-PDLSCs成牙骨質礦化能力也減弱，由此，可推測疾病狀態(tài)下牙周組織遭到影響與破壞，進一步影響了牙周膜干細胞增殖及分化為成牙骨質細胞的能力，導致牙周組織再生修復受到障礙。

牙周炎是以牙周軟硬組織的破壞和改建為主要表現的發(fā)病率較高的疾病，嚴重影響口腔健康，并且可能影響糖尿病等其它系統性疾病。在牙周組織破壞中起著重要作用的炎性細胞因子是白細胞介素-1β(Interleukin，IL- 1β)和腫瘤壞死因子- α(Tumor necrosis factor alpha，TNF- α)[20-21]。這些炎性細胞因子在牙周的炎癥病變部位和組織破壞期間顯著升高[20]。此外，在牙周治療和組織恢復到健康狀態(tài)后，這些細胞因子顯著降低[21]。

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于胰島素分泌缺陷或其生物學功能受損而引起的糖、脂肪、蛋白質、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，其典型特征為高血糖。2型糖尿病主要表現為胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)，即胰島 β細胞能夠產生足夠濃度的胰島素，但機體組織細胞對正常濃度的胰島素反應不足，需要更高濃度的胰島素才能發(fā)揮正常的生物學效應。研究表明，感染導致胰島素抵抗狀態(tài)，細菌內毒素對胰島素敏感性有顯著影響[22]。已經證明，IL-1β通過凋亡機制促進蛋白激酶C的激活，導致胰腺β細胞的破壞[23]。此外，IL-1β通過耗盡細胞儲能和產生一氧化氮，對β細胞具有細胞毒作用。在動物模型和人體研究中，TNF-α已被認為是胰島素抵抗和2型糖尿病的病因[24-25]。TNF-α的升高水平會改變細胞內胰島素的信號傳導(抑制胰島素受體的酪氨酸激酶活性)并減少其合成。胰島素反應性葡萄糖轉運蛋白，產生類似于2型糖尿病的胰島素抵抗的胰島素抵抗綜合征[25-26]。

綜上所述，2型糖尿病伴牙周炎疾病狀態(tài)下，牙周膜干細胞的向成牙骨質細胞分化能力降低，并且細胞的礦化水平也降低，牙周組織再生修復能力較差，出現此類情況可能源于高血糖狀態(tài)、以及牙周毒力因子和局部微環(huán)境因素的影響，但牙周炎以及全身疾病狀態(tài)的糖尿病如何協同影響牙周組織再生修復內在分子機制的探索仍是研究學者們應該進一步關注的方向。